Per iniziare, prepara i supporti per morsetti e i morsetti metallici. Posizionare i supporti per morsetti corrispondenti con un morsetto metallico ciascuno nella stazione di montaggio. Posizionare i pezzi di carta autoclavata bagnati sopra i morsetti metallici.
Tagliare la carta lungo i bordi interni delle pinze con il bisturi. Taglia altri due pezzi di carta più piccoli e tienili umidi. Usando una pinzetta appuntita, posiziona otto espianti di anime sulla carta tra i morsetti metallici con i loro punti finali sui morsetti.
Coprire i punti finali degli espianti di anime con pezzi di carta più piccoli e posizionare sopra dei morsetti metallici. Utilizzare un cacciavite e piccole viti per fissare gli espianti del nucleo tra i morsetti metallici e il supporto del morsetto. Trasferire con cautela gli espianti del nucleo bloccato in camere di coltura in silicone e riempire queste camere con due millilitri di terreno di coltura cellulare standard.
Quindi fissare il gruppo con viti aggiuntive. Per preparare l'idrogel di collagene, rimuovere prima le cellule bersaglio dalle piastre di coltura tissutale utilizzando una soluzione di distacco cellulare. Quindi centrifugare a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi risospendere in un millilitro di terreno di coltura standard.
Successivamente, preparare una soluzione reticolante mescolando 10 microlitri di PBS, 1,28 microlitri di NaOH molare e 8,72 microlitri di acqua bidistillata per assembloide. Aggiungere la sospensione cellulare di un massimo di 12 assemloidi e posizionare la provetta sul ghiaccio. Regolare la sospensione cellulare in modo tale da ottenere le seguenti concentrazioni finali.
Preparare separatamente una soluzione di collagene aggiungendo 80 microlitri di collagene, uno per assembloide, e posizionare la provetta sul ghiaccio. Una volta che le soluzioni sono pronte sul ghiaccio, aspirare il terreno di coltura cellulare dalle camere contenenti gli espianti del nucleo bloccato. Aggiungere la soluzione di collagene one alla soluzione di reticolazione e mescolare pipettando rapidamente senza creare bolle.
Aggiungere 200 microlitri della soluzione miscelata nelle scanalature delle camere in silicone per coprire i singoli espianti del nucleo tendineo. Lasciare polimerizzare gli idrogel per 50 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi riempire con cura le camere di coltura in silicone con 1,5 millilitri del rispettivo terreno di co-coltura pipettandolo negli angoli delle camere.
Mettere le camere in una grande capsula di Petri o in una scatola sterile prima di metterle in un'incubatrice. Coltivare gli assiebloidi in condizioni appropriate, cambiando il terreno di coltura due volte alla settimana. Rimuovere gli assembloidi dai morsetti con le forbici.
Se necessario, utilizzare una pinzetta per separare gli espianti del nucleo dallo scomparto esterno dell'idrogel. Dopo aver colturato l'assembloide in condizioni di coltura simili a lesioni per oltre 21 giorni, è stato osservato che l'espianto del nucleo rimaneva meccanicamente estensibile, invariato nell'aspetto, visivamente distinguibile e fisicamente separabile dall'idrogel circostante. Inoltre, l'idrogel circostante si è compattato nel tempo, a seconda della popolazione di cellule seminate con fibroblasti derivati dal tendine d'Achille che contraevano l'idrogel circostante più velocemente.
La valutazione al microscopio confocale per la vitalità, la morfologia e la diffusione cellulare nell'idrogel di collagene 3D ha rivelato che la vitalità è stata mantenuta durante la coltura dell'assembloide almeno fino al settimo giorno. Inoltre, l'espressione genica di Vegfa e Mmps è aumentata fortemente negli espianti del core, come si è visto dall'analisi trascrittomica. Allo stesso modo, l'analisi del secretoma ha rilevato la presenza di citochine come il fattore di crescita dell'endotelio vascolare negli espianti del nucleo.
