Per iniziare, seleziona un terreno di crescita dei nematodi o una piastra NGM occupata da larve di Caenorhabditis elegans allo stadio L1 affamate. Usando un millilitro di acqua sterile, lavare delicatamente i vermi dal piatto. Aliquotare circa 300 microlitri della popolazione di vermi su piastre NGM seminate con OP50 concentrato.
Lasciare asciugare le piastre utilizzando un essiccatore a piastre o un bruciatore Bunsen, quindi incubare a 20 gradi Celsius fino a quando una popolazione significativa non diventa adulta gravida. Per raccogliere i vermi, lavarli via dalla piastra con un massimo di 10 millilitri di acqua sterile e trasferire una miscela di acqua calda in un tubo conico da 15 millilitri. Lasciare che i vermi si depositino per gravità sul fondo del tubo per circa quattro minuti.
Utilizzando una piccola punta di pipetta, aspirare con cura ed eliminare il surnatante. Quindi aggiungere fino a 15 millilitri di acqua sterile. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante e aggiungere cinque millilitri di una soluzione appena preparata di candeggina e idrossido di sodio.
Incubare i vermi per cinque minuti a temperatura ambiente mentre si agitano ogni minuto per almeno 10 secondi. Monitora i progressi utilizzando un microscopio da dissezione. Una volta che tutti gli adulti si aprono o si dissolvono, aggiungere un tampone M9 per neutralizzare la reazione, portando il volume finale a 15 millilitri.
Quindi centrifugare la provetta per due minuti a 1,300 G.Lavare le uova altre due volte con 13 millilitri di tampone M9 tramite centrifugazione seguito da un singolo lavaggio con 15 millilitri di tampone completo S. Quindi centrifugare le uova per due minuti a 1,300 G.Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di tampone completo S. Ruotare delicatamente il tubo a temperatura ambiente durante la notte utilizzando un mutatore o un dispositivo simile.
Usando un microscopio da dissezione, valuta se i vermi si sono schiusi. Contare i vermi in gocce da 10 microlitri di tampone S al microscopio. Preparare una miscela liquida di vermi con 60 vermi per millilitro in terreno completo S contenente carbenicillina, amfotericina B e OP50.
Aggiungere 120 microlitri di terreno con vermi alle file da A a G e nessun mezzo senza vermi alla fila H.Quindi sigillare la piastra con un sigillante a nastro per evitare la contaminazione e l'evaporazione. Incubare le piastre sigillate per circa 65 ore a 20 gradi Celsius fino a quando gli animali diventano vermi L4. Aggiungere 30 microlitri di una soluzione madre di fluorodesossiuridina 0,6 millimolare a ciascun pozzetto per sterilizzare gli animali allo stadio L4.
Richiudere la piastra con sigillanti a nastro adesivo e agitarla per 20 minuti a 800 giri/min su uno shaker per piastre per microtitolazione. Rimetti le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungi la droga di interesse alla cultura del primo giorno.
Richiudere le piastre con un sigillante a nastro adesivo e agitare per 20 minuti a 800 giri/min su uno shaker per piastre. Quindi, dopo aver rimosso il coperchio e il sigillo, misurare l'OD600 in un lettore di piastre per la misurazione del primo giorno. Richiudere e rimettere le piastre in un'incubatrice a 20 gradi Celsius.
Utilizzando un microscopio invertito, preferibilmente con un obiettivo a due tempi, contare la popolazione di vermi in ogni pozzetto e registrare i numeri in un foglio di calcolo. Dopo il conteggio, rimetti le piastre nell'incubatrice a 20 gradi Celsius. La curva dose-risposta, una variazione completa dell'assunzione di cibo in funzione della concentrazione di serotonina, ha dimostrato che il ceppo N2 può mangiare troppo in modo dose-dipendente.
Il mutante daf-16 mu86 mostra un'alimentazione basale più elevata rispetto a N2. Tuttavia, non può rispondere alla serotonina nello stesso modo dose-dipendente del ceppo N2. Una differenza significativa è stata osservata nell'assunzione di cibo di vermi trattati con loxapina ma alimentati con batteri uccisi dai raggi X, dai raggi gamma o dalla paraformaldeide. Il confronto dell'assunzione di cibo di una serie di ceppi genetici ha mostrato che i mutanti exc-4 e cgr-1 mangiano meno mentre i mutanti srp-6 mangiano di più.
