Per iniziare, etichettare due provette da microcentrifuga da un millilitro. Pipettare aliquote da 50 microlitri di colture di E.coli DnaK756 nelle provette. Metti i tubi sul ghiaccio.
Aggiungere da 10 a 50 nanogrammi di DNA plasmidico in ogni provetta separata con le aliquote di E.coli. Tenere i tubi sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi, posiziona le celle a 42 gradi Celsius per 60 secondi per eseguire uno shock termico per le cellule.
Rimettere i tubi nel ghiaccio per 10 minuti. Pipettare 950 microlitri di brodo di triptone lievitato fresco due volte nelle provette, quindi incubare le provette in uno shaker a 37 gradi Celsius. Pipettare 100 microlitri di coltura cellulare trasformata e distribuirli su piastre di agar con due volte triptone di lievito contenente antibiotici.
Centrifugare il resto delle cellule per un minuto a 5.000 G a quattro gradi Celsius. Decantare circa 800 microlitri di brodo. Risospendere le cellule pellettate nei terreni rimanenti.
Placcare le cellule recuperate su una piastra di agar di triptone di lievito due volte, quindi incubare entrambe le piastre di agar a 37 gradi Celsius per una notte. Per placcare le cellule, utilizzare un anello sterile per prelevare una singola colonia dai trasformanti. Inoculare in 10 millilitri di brodo di triptone lievitato due volte, integrato con antibiotici.
Ora, preparare le diluizioni seriali delle cellule da 100 a 10 al quinto negativo in provette da microcentrifuga da due millilitri. Prima di individuare le cellule, posizionare le piastre di agar integrate con antibiotici e IPTG in un forno a 40 gradi Celsius con i coperchi parzialmente aperti. Una volta che le piastre sono sufficientemente asciutte, individuare due microlitri di cellule diluite in serie sulle piastre di agar.
Individuare ogni campione su due piastre separate. Incubare una piastra alla temperatura di crescita permissiva di 37 gradi Celsius e l'altra alla temperatura di crescita non permissiva di 43,5 gradi Celsius. Per confermare l'espressione delle proteine ricombinanti, utilizzare un anello sterile per prelevare parte delle cellule rimanenti dalla stessa colonia di trasformanti.
Inoculare le cellule in 10 millilitri di brodo di lievito e triptone integrato con antibiotici. Incubare le colture su uno shaker per una notte a 37 gradi Celsius. Tutte le cellule di E.coli DnaK756 sono cresciute alla temperatura di crescita permissiva di 37 gradi Celsius.
Tuttavia, solo le cellule eterologhe che esprimono DnaK e KPf sono cresciute alla temperatura di crescita non permissiva. Le cellule mutanti che esprimono KPf-V436F sono cresciute solo a 37 gradi Celsius, ma non sono riuscite a crescere a 43,5 gradi Celsius.
