Per iniziare, centrifugare i normali fibroblasti dermici umani tripsinizzati. Rimuovere il surnatante dalla provetta centrifugata. Aggiungere al pellet un mezzo a basso contenuto di glucosio DMEM integrato preriscaldato e mescolare bene per risospenderlo.
Placcare i normali fibroblasti dermici umani in un piatto di coltura cellulare aderente di 10 centimetri. Scuotere delicatamente il piatto in modo trasversale. Dopo 14 giorni di stimolazione 2D, quando le cellule sono diventate confluenti, aspirare il terreno e utilizzare un raschietto cellulare per staccare delicatamente e rapidamente il foglio cellulare formato dal piatto.
Contemporaneamente, arrotolare il foglio cellulare in un organoide 3D simile a un bastoncino. Trasferire i normali organoidi di fibroblasti dermici umani in una capsula di Petri non aderente larga 10 centimetri. Misurare l'allungamento con un righello.
Quindi tenere un lato dell'organoide con una pinzetta e allungare delicatamente l'organoide fino a quando non è stato allungato assialmente di circa il 10%Usando una pinzetta, premere manualmente i perni metallici attraverso entrambi i bordi dell'organoide nel piatto di plastica per fissarlo. Infine, per la maturazione 3D, aggiungere 10 millilitri di terreno ad alto contenuto di glucosio integrato con DMEM preriscaldato prima dell'incubazione. La morfologia grossolana degli organoidi 3D al giorno zero e al giorno 14 della fase di maturazione 3D ha mostrato un aspetto bianco scintillante.
Nel tempo, gli organoidi si sono contratti e sono apparsi più densi. La morfologia degli organoidi è stata valutata utilizzando la colorazione HE. Il primo giorno, gli organoidi hanno mostrato strati disconnessi, composti principalmente da cellule circondate da basse quantità di matrice.
Le cellule all'interno degli strati mostravano nuclei di forma rotonda e di dimensioni variabili. Il 14° giorno è stato osservato un notevole aumento del segnale eosina, che indicava la deposizione di matrice e strati fusi. Inoltre, gli organoidi hanno mostrato la presenza di aree contenenti cellule allineate.
La maggior parte dei nuclei aveva dimensioni simili e occasionalmente erano allungati.
