Per iniziare, apri il software e seleziona l'opzione per creare un nuovo file del DNA. Preparare la sequenza genica PRRSV da NCBI e fare clic su OK per generare i file di sequenza. Analizza la sequenza e segna le giunzioni dei frammenti.
Identificare tutte le giunzioni prima di progettare i primer di sequenza specifici per i frammenti. Quindi fare clic su Primer e scegliere Aggiungi primer. Incolla la sequenza specifica e aggiungi le sequenze sovrapposte del vettore ai primi cinque nucleotidi primi del primer.
Assegna un nome al primer in avanti e fai clic su Aggiungi primer al modello per incorporare il primer progettato nel modello. Quindi contrassegnare le giunzioni dei frammenti e progettare l'innesco della sequenza specifica inversa dei frammenti. Ancora una volta, vai su Primer e seleziona Aggiungi primer.
Inserisci la sequenza specifica. Aggiungi il sito di restrizione ai primi cinque nucleotidi primi. Inoltre, includere da 20 a 40 coppie di basi di sequenze di overhang vettoriale ai primi cinque nucleotidi primi del sito di restrizione.
Assegna un nome al primer inverso e seleziona Aggiungi primer al modello. Successivamente, impostare sei reazioni PCR individuali utilizzando i sei frammenti e le coppie di primer progettate. Eseguire la PCR seguendo un protocollo in tre fasi, come mostrato di seguito.
Dopo il completamento della PCR, pipettare un microlitro di sei tamponi di caricamento xDNA con cinque microlitri di prodotto PCR. Mescolare e centrifugare brevemente. Analizzare i campioni utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%.
Per costruire un gene a lunghezza intera, sono stati amplificati frammenti di PRRSV utilizzando sei reazioni PCR. Le dimensioni dei frammenti sono state confermate mediante elettroforesi su gel di agarosio.
