Inizia linearizzando il vettore. Preparare la miscela di reazione contenente enzimi di restrizione specifici a temperatura ambiente. Utilizzare un kit di estrazione su gel per purificare i vettori linearizzati, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti.
Quindi, assemblare il clonaggio senza soluzione di continuità dell'esone R e la reazione di assemblaggio per subclonare il gene PRRSV. Regolare il volume totale di reazione a 10 microlitri con acqua deionizzata sterilizzata. Quindi, mescola accuratamente.
Incubare la miscela in un termociclatore per 15-60 minuti a 50 gradi Celsius. Successivamente, conservare i campioni su ghiaccio. Dopo aver trasformato il vettore in cellule competenti, prelevare otto colonie in 20 microlitri di terreno LB contenente kanamicina.
Impostare una reazione di PCR a colonia per analizzare i trasformanti. Un vettore di sovraespressione di PRRSV a lunghezza intera è stato ottenuto introducendo il frammento uno di PRRSV nel vettore pVAX1, creando pVAX1-F1. Cicli successivi di ricombinazione utilizzando specifici enzimi di restrizione hanno portato all'incorporazione di frammenti da due a cinque, visualizzati da un aumento delle dimensioni del plasmide.
