Iniziare eseguendo il test MM QPCR per la misurazione della lunghezza dei telomeri. Quindi apri il software e seleziona la funzione di configurazione della piastra. Successivamente, scegli l'opzione Visualizza o modifica piastra dal menu a discesa.
Ora evidenzia tutti i pozzetti sulla piastra. Fare clic su Seleziona florafori. Seleziona la casella Cyber e assicurati che tutte le altre caselle siano deselezionate.
Quindi fare clic su OK per confermare. Mantenendo l'evidenziazione su tutti i pozzi, individua e seleziona la casella accanto a cyber, adiacente alla parola carico per etichettare tutti i pozzi con cyber. Evidenziare ora i tre pozzetti di controllo non modello posizionati nella parte superiore o inferiore della diluizione seriale di controllo standard.
Quindi, dal menu del tipo di campione a destra, selezionare NTC. Evidenziare i 21 pozzetti che compongono la diluizione seriale di controllo standard e scegliere standard dal menu del tipo di campione. Mentre questi pozzi sono ancora selezionati, fare clic su replica tecnica, nel menu delle dimensioni di replica, sceglierne tre.
Quindi selezionare orizzontale e fare clic su Applica. Successivamente, scorri verso il basso fino alla sezione della serie di diluizione e inseriscine due nel campo del fattore di diluizione. Per la piastra P1, inserire due volte 10 alla potenza di tre negativo nel campo di concentrazione iniziale.
Quindi selezionare la casella per la diminuzione e fare clic su applica per confermare le impostazioni. Per la targa P2, inserisci 3,13 volte 10 alla potenza di cinque negativo nel campo di concentrazione iniziale. Assicurati di selezionare la casella per l'aumento, quindi seleziona applica per finalizzare la configurazione.
Ora evidenzia le colonne corrispondenti alla striscia PCR A dal menu del tipo di campione, scegli sconosciuto, quindi procedi con la selezione della replica tecnica. Nel menu Replica dimensioni, selezionatene tre e scegliete l'orizzontale prima di fare clic su Applica. Fare clic su OK in basso a destra nella finestra dell'editor delle lastre.
Confermare le modifiche facendo clic su Sì quando richiesto. Successivamente, verificare che le curve nella scheda di quantificazione appaiano appropriate sia per il passaggio nove che per il passaggio 12 e che i valori di efficienza tra questi due passaggi non divergano di oltre il 10%Per P1, selezionare il passaggio nove ed evidenziare i 21 pozzetti corrispondenti alla curva standard. Copiare i valori CQ dall'angolo in basso a destra della finestra del software.
Quindi apri il modello di foglio dati Telomere e incolla questi valori nella colonna standard di un foglio B.Successivamente, inserisci il valore di pendenza del passaggio nove nella cella C quattro nel foglio standard, controlla che il coefficiente di variazione per ogni triplicato di diluizione standard sia inferiore a 0.1. Su CFX, escludere dall'analisi tutti i punti dati anomali che fanno sì che un set di triplicati non rientri nell'intervallo. A questo punto, verificare che solo i 72 pozzetti campione nel file di analisi P1 siano evidenziati in blu nella scheda di quantificazione.
Quindi, nel passaggio nove, copiare i valori CQ e SQ che si trovano nell'angolo in basso a destra della finestra del software e incollarli nel foglio P1 degli esempi a partire dalla cella D3. Utilizzando CFX maestro, assicurarsi che tutti i valori CQ per i campioni analitici rientrino nell'intervallo dei valori CQ più bassi e più alti della curva standard. Nel foglio Excel, verificare che la concentrazione iniziale nell'NTC sia inferiore al 5% della quantità media di DNA nei pozzetti del campione. Per il controllo di qualità a livello di campione, esaminare le deviazioni standard e il coefficiente di variazione nelle colonne J e K sui fogli P1 e P2 dei campioni.
Verificare che le CV interplacca del singolo campione nel foglio P1 rispetto a P2, in particolare nella colonna G, non superino 0,05. Se il CV interpiatto di un campione è superiore a quello accettabile, rimuovere fino a un triplicato dal calcolo per ciascun campione. Per il controllo di qualità a livello di piastra, verificare che la variazione media tra le piastre tra tutti i campioni su ciascuna piastra sia inferiore a 0,05.
Se il CV interpiatto di un campione è superiore a quello accettabile, rimuovere fino a un triplicato dal calcolo per ciascun campione. Per un ulteriore controllo di qualità a livello di lastra, verificare che la variazione complessiva dell'interpiastra nel foglio P1 rispetto a P2 sia inferiore a 0,06.
