Preparazione di cellule RSC96 crioconservate per la stimolazione del campo elettrico pulsato a nanosecondi

Per iniziare, posizionare la fiala criogenica contenente un millilitro di sospensione cellulare RSC96 in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitandola rapidamente. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga contenente da quattro a sei millilitri di terreno di coltura completo e mescolare bene. Centrifugare la provetta a 1.000 G per tre-cinque minuti, quindi scartare il surnatante e risospendere le cellule in tre millilitri di terreno di coltura completo.

Aggiungere ora la sospensione cellulare a un pallone di coltura contenente 628 millilitri di terreno di coltura completo e incubare a 37 gradi Celsius per una notte. Una volta che la densità cellulare raggiunge l'80-90%, scartare il terreno di coltura e sciacquare le cellule una o due volte con PBS senza ioni calcio e magnesio. Quindi aggiungere 0,25% di tripsina, 0,53 millimolare di EDTA al pallone di coltura.

Al termine dell'incubazione, osservare al microscopio il distacco delle cellule. Una volta che la maggior parte delle celle diventa rotonda e staccata, rimetti rapidamente il pallone nell'area di lavoro e picchiettalo delicatamente. Aggiungere da tre a quattro millilitri di terreno di coltura contenente il 10% di FBS per fermare la digestione.

Quindi mescolare accuratamente il contenuto del pallone e aspirare la soluzione. Centrifugare la sospensione cellulare. Aggiungere 1.000 G per cinque minuti.

Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in uno o due millilitri di terreno di coltura fresco con un pipettaggio delicato. Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo pallone T25. Aggiungere un rapporto uno a due e aggiungere sette millilitri di terreno di coltura.