Per iniziare, HEK293T le cellule aggiungendo 22 millilitri di terreno di coltura integrato in 10 piastre di coltura trattate di 15 centimetri di diametro. Incubare le piastre per 24 ore per raggiungere il 70-80% di confluenza. Per la trasfezione cellulare, preparare una miscela combinando i reagenti in una provetta da microcentrifuga e mescolare picchiettando.
Aggiungere la miscela di trasfezione a 4,56 millilitri di DMEM non integrato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e mescolare picchiettando. Quindi, aggiungere 1,37 millilitri di soluzione sterile di polietilenimmina goccia a goccia. Mescolare picchiettando e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per formare complessi di polietilenimmina di DNA.
Aggiungere questa miscela in 231 millilitri di DMEM integrato preriscaldato. Sostituire il terreno di coltura in ogni piatto di coltura con 22 millilitri di questa miscela di trasfezione e incubare le cellule per 48 ore. Se il PITR codifica un reporter fluorescente, osservare le cellule trasfettate al microscopio a fluorescenza.
Quindi, raccogli il mezzo da ogni piatto. Centrifugare a 800 G per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Quindi, aggiungi 10 millilitri di PBS preriscaldato alla piastra e usa un raschietto cellulare per rimuovere le cellule.
Raccogliere la sospensione cellulare nelle provette da centrifuga contenenti il pellet cellulare. Assicurati che tutte le cellule vengano raccolte lavando cinque piatti alla volta con 10 millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente per pellettare le cellule.
Per l'estrazione con rAAV, scongelare i pellet cellulari trasfettati e risospendere in 100 millilitri di tampone sterile e pipetta per garantire una sospensione omogenea. Quindi, aggiungere 12,5 millilitri di una soluzione sterile di desossicolato di sodio al 10% preparata al momento per indurre la lisi cellulare e miscelare mediante pipettaggio. Aggiungere 27 microlitri di nucleasi benzonasica e mescolare accuratamente fino a quando la miscela non è più viscosa.
Incubare a 37 gradi Celsius, vorticando ogni 10 minuti, per un'ora. Centrifugare a 3.000 G per 60 minuti a 25 gradi Celsius. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro per siringa in PVDF da 0,45 micron in un nuovo contenitore sterile.
