Per iniziare, posiziona un colino da 70 micrometri su un tubo di polipropilene da cinque millilitri. Pipettare sopra di esso 500 microlitri di terreno cellulare neurale. Trasferire l'omogeneizzato di tessuto di ippocampo di topo dissociato nella provetta attraverso il colino.
Quindi pipettare due volte un millilitro di terreno cellulare neurale freddo sull'omogeneizzatore per risciacquarlo. Ora, aggiungi 500 microlitri di DPBS ghiacciato al pellet per risospenderlo. Aumentare il volume della sospensione a 1,5 millilitri con DPBS.
Pipettare 500 microlitri di soluzione isotonica di percoll nel campione. Sovrapporre la soluzione con due millilitri di DPBS freddo in centrifuga. Quindi aspirare lo strato superiore e il disco mielinico nella fase intermedia.
Quindi, aggiungere quattro millilitri di DPBS freddo nella provetta, aspirare il surnatante dopo averlo centrifugato. Quindi risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione colorante di vitalità fissabile. Pipettare un millilitro di DPBS freddo nel campione prima di centrifugare il campione a 300 x g per cinque minuti.
Dopo aver aspirato il surnatante, aggiungere 100 microlitri di soluzione colorante CD16, CD32. Agitare il campione per cinque secondi, quindi incubare. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone FACS nel campione e centrifugare.
Pipettare 100 microlitri della miscela master di colorazione nella provetta. Quindi incubare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Ora, aggiungere un millilitro di tampone FACS al campione prima di centrifugare come prima.
Risospendere il pellet in 250 microlitri di tampone di fissazione dopo aver scartato il surnatante. Quindi, aggiungere due millilitri di tampone di permeabilizzazione alla provetta e centrifugare nuovamente. Pipettare 100 microlitri di soluzione colorante vGLUT1 nel pellet.
Quindi agitare la miscela per circa cinque secondi prima dell'incubazione e della centrifugazione. Risospendere il pellet cellulare in 250 microlitri di tampone FACS. Infine, filtrare i campioni attraverso un filtro da 40 micrometri.
Un segnale fluorescente vGLUT1-PE più elevato è stato osservato dalla microglia ippocampale rispetto al controllo dell'isotipo. Un segnale fluorescente vGLUT1-PE più elevato è stato trovato nella microglia dal bulbo olfattivo e un segnale più basso nel cervelletto rispetto all'ippocampo. L'intensità del segnale più bassa è stata rilevata nei macrofagi della milza.
