Per iniziare, incubare un tubo contenente tessuto ippocampale di topo dissociato in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Trasferire la sospensione di celle torbide in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri della soluzione di miscela di lavaggio.
Successivamente, passare il campione attraverso un filtro da 70 micrometri in una provetta da microcentrifuga da cinque millilitri prima di centrifugare nuovamente. Sottoporre il campione a centrifugazione in gradiente Percoll, quindi risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di tampone di colorazione MACS e incubare. A questo punto, pipettare un millilitro di tampone MACS nel campione prima della centrifugazione.
Quindi, sospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone MACS. Successivamente, sciacquare le colonne di selezione positiva di un separatore magnetico con tre millilitri di tampone MACS. Applicare delicatamente 500 microlitri di sospensione cellulare su una colonna.
Dopo aver lavato le colonne tre volte con tampone MACS, posizionare le colonne su tubi conici da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di tampone MACS sulla colonna. Quindi, centrifugare i campioni a 300 g per 10 minuti, quindi aggiungere un millilitro di DMEM preriscaldato al pellet.
Trasferire 500 microlitri della sospensione cellulare finale nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Sostituire 250 microlitri di ogni pozzetto con DMEM fresco e preriscaldato. Quindi, aggiungi tre microgrammi di sinaptosomi marcati con pHrodo Red sul terreno.
Aggiungere lo stesso volume di sinaptosomi non marcati ai controlli negativi. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti con DPBS freddo. Ora, pipettare 200 microlitri di tripsina-EDTA in ogni pozzetto.
Dopo un'incubazione di 35 secondi, pipettare un millilitro di DPBS contenente FBS in ciascun pozzetto. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di polipropilene da cinque millilitri attraverso un colino, quindi lavare ogni pozzetto due volte con 500 microlitri di DPBS ghiacciato. La centrifuga ha raccolto campioni a 500 g per cinque minuti.
Successivamente, incubare le cellule in 100 microlitri di soluzione colorante per 10 minuti su ghiaccio. Quindi, aggiungere CD11b e CD45 alla soluzione colorante per ottenere una concentrazione finale da 1 a 100. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius per 20 minuti al buio.
Pipettare un millilitro di tampone FACS nel campione, quindi sottoporlo a una centrifugazione finale a 300 g per 10 minuti prima dell'analisi citofluorimetrica. Una fluorescenza PE positiva paragonabile a quella ottenuta dai sinaptosomi a pH 4 è stata osservata nelle microglia CD11b-positive e CD45-positive.
