Per iniziare, prendi le cellule muscolari scheletriche colorate con cisplatino, anticorpi coniugati metallici e soluzione intercalatore-iridio e pellet le cellule mediante centrifugazione. Una volta rimosso il surnatante, aggiungere un millilitro di CSM alle celle vortex. Pellettare le celle mediante centrifugazione e lavarle in un millilitro di tampone CAS.
Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante a circa 200 microlitri. Aggiungere un millilitro di tampone CAS ai campioni vortex e aliquotare cinque microlitri per la conta cellulare. Dopo aver centrifugato le cellule e aspirato il surnatante a 50 microlitri, risospendere le cellule in tampone CAS a una concentrazione finale di 1 milione di cellule per millilitro e aggiungere le perle di calibrazione per ottenere una concentrazione finale di 0,1x.
Caricare il campione nel citometro di massa per raccogliere i dati utilizzando una velocità di flusso da 400 a 500 cellule al secondo e normalizzare i dati dopo la raccolta. Se necessario, concatenare i singoli file standard di citometria a flusso o FCS per ciascun campione in un unico file. Identifica le singole cellule controllando gli eventi positivi dell'intercalatore all'iridio.
Selezionare gli eventi negativi per il cisplatino per il gate per le cellule vive. Effettuare il gate sulla popolazione di interesse e quantificare la proporzione relativa di cellule staminali e progenitrici. Per eseguire analisi ad alta dimensionalità, esportare la popolazione di interesse e utilizzare algoritmi di clustering.
Per l'analisi X-shift, scarica il pacchetto software Vortex e Java a 64 bit. Caricare le popolazioni di celle esportate in un database locale e definire i parametri di clustering. Per visualizzare le relazioni spaziali tra le popolazioni cellulari all'interno dei cluster X-shift, eseguire un layout diretto dalla forza.
L'analisi CyTOF ha identificato una sequenza di quattro popolazioni, cellule staminali e popolazioni progenitrici da una a tre. Le popolazioni progenitrici P1 e P2 corrispondono a cellule progenitrici sempre più mature. P3 è stato precedentemente identificato ma non caratterizzato a causa della sua bassa abbondanza.
La dinamica delle cellule staminali e progenitrici dopo l'infortunio è stata analizzata utilizzando CD9 da CD104 mediante grafici a punti assiali. Il terzo giorno è stato osservato un notevole aumento della popolazione di cellule staminali, suggerendo un'espansione. Ciò è stato supportato da un aumento dell'incorporazione di iododesossiuridina, che indica la proliferazione cellulare, e da un'aumentata espressione di MyoD, come mostrato dalla sovrapposizione di colori.
Sono state identificate cellule staminali attivate caratterizzate da alti livelli di CD98, CD44, MyoD e iododesossiuridina, sottolineando la loro elevata proliferazione e lo stato attivato al terzo giorno dopo l'infortunio.
