Poiché i FAP sono mediatori della rigenerazione muscolare e della fibrosi patologica, il nostro protocollo consente la caratterizzazione della dinamica FAP post lesione muscolare e l'isolamento dei FAP per studi in vitro o ex vivo. Ad oggi, gli studi sono stati condotti esclusivamente su FAP isolati da topi. Il nostro protocollo consente un efficace isolamento dei FAP dal ratto più grande, fornendo una maggiore disponibilità di tessuto per i test a valle.
Il tempo prolungato di elaborazione dei tessuti può avere un impatto negativo sulla vitalità dei FAP. Se più campioni vengono elaborati contemporaneamente, si consiglia a due operatori di eseguire il protocollo in tandem per massimizzare la vitalità delle cellule isolate. Inizia posizionando il tessuto muscolare raccolto in un piatto sterile di coltura cellulare di 10 centimetri.
Strappare e tritare delicatamente il tessuto con una pinza e rimuovere il tessuto connettivo per ottenere circa tre o quattro millimetri di pezzi cubetti. Trasferire il tessuto minster in un tubo conico sterile da 50 millilitri contenente sei millilitri di DMEM e l'1% di penicillina-streptomicina. Quindi, attivare 365 microlitri di soluzione di collagenasi II aggiungendo 10 microlitri di soluzione di cloruro di calcio da 300 millimolari.
Aggiungere la soluzione di collagenasi II attivata al liquame tissutale per una concentrazione finale di 250 unità per millilitro. Incubare i tubi in uno shaker per un'ora e a 37 gradi Celsius a 240 x g con agitazione manuale ogni 15 minuti per rimuovere il tessuto aderente al lato del tubo. Dopo un'ora di incubazione, aggiungere 100 microlitri di collagenasi II e 50 microlitri di dispasi al campione.
Quindi, la pipetta campiona da 15 a 20 volte con una pipetta sierologica fino a quando la soluzione non è omogenea. Incubare nuovamente il campione per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 240 x g con agitazione manuale ogni 15 minuti. Tagliare lentamente i campioni di soluzione muscolare attraverso una siringa da 20 millilitri con un ago calibro 20 per 10 cicli.
Quindi, posizionare un colino cellulare da 40 micron su un tubo conico sterile da 50 millilitri e bagnarlo pipettando cinque millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Pipettare il campione un millilitro alla volta attraverso il colino. Una volta filtrato l'intero campione, lavare il filtro cellulare con DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina per portare il volume totale del campione a 25 millilitri.
Dividere equamente il volume del campione in due tubi conici da 15 millilitri e centrifugare a 15 gradi Celsius, 400 x g per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospesare il pellet in un millilitro di tampone di lisi RBC a temperatura ambiente per sette minuti. Quindi, aggiungere nove millilitri di tampone di lavaggio per portare il volume a 10 millilitri e centrifugare a 15 gradi Celsius, 400 x g per 15 minuti.
Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospesare il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio. Trasferire un volume appropriato di cellule in un tubo microcentrifuga separato da 1,5 millilitri e mescolarlo con colorante blu tripano. Conta le cellule vive su un microscopio ottico usando un emocitometro.
Per la citometria a flusso, trasferire da uno a 2 milioni di cellule per campione sperimentale in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri. Portare il volume del campione a un millilitro con tampone di lavaggio e posizionare il tubo sul ghiaccio. Impostare tutti i controlli per l'esperimento.
Per i controlli cellulari, aliquote da 500.000 a 1 milione di celle in un millilitro di tampone di lavaggio in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Se l'esperimento viene eseguito per la prima volta, dovrebbero essere incluse anche sospensioni cellulari a colorazione singola. Per impostare i controlli delle perline, aggiungere circa 150.000 perline di compensazione positiva a ciascun tubo centrifugo da 1,5 millilitri etichettato.
Preparare il controllo di vitalità trasferendo metà del volume della cella dal tubo di vitalità al tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettato morto. Incubare il tubo morto a 65 gradi Celsius per due o tre minuti, quindi posizionarlo sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, restituire le cellule morte al tubo di vitalità.
Centrifugare le sospensioni monocellulari, compresi i campioni sperimentali e di controllo a 500 x g e quattro gradi Celsius per cinque minuti, e risospendere i pellet cellulari in 100 microlitri di tampone di lavaggio dopo aver aspirato il surnatante. Aggiungere anticorpi in base alle condizioni di controllo o sperimentali e scorrere delicatamente il campione per garantire una miscelazione completa. Quindi, incubarli sul ghiaccio al buio per 15 minuti.
Per le perle di compensazione, incubare il tubo a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Porta il volume di ciascun campione a un millilitro aggiungendo 900 microlitri di tampone di lavaggio alla sospensione a cella singola e 900 microlitri di PBS per i controlli delle perline di compensazione. Centrifugare sospensioni monocellulari a 500 x g e quattro gradi Celsius per cinque minuti e controlli di perline di compensazione a 300 x g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione dei campioni, aspirare il surnatante e risospese il pellet cellulare in 300 microlitri di tampone di lavaggio e i controlli del tallone in 300 microlitri di PBS e 150.000 perle di compensazione negativa. Conservare i campioni di cellule su ghiaccio e campioni di perline a temperatura ambiente sotto un foglio di alluminio. Procedere con l'acquisizione della citometria a flusso impostando la strategia di gating per identificare progenitori fibro-adipogeni e progenitori miogeni.
Nell'analisi rappresentativa, è stata confermata la coniugazione riuscita dell'anticorpo Sca-1 APC con singola colorazione di perline di compensazione e sospensioni cellulari generate da muscolo gastrocnemio di ratto sano. Cinque diverse concentrazioni di Sca-1 APC sono state titolate su sospensioni monocellulari e la concentrazione ottimale di anticorpi è stata identificata in base alla massima intensità di fluorescenza con colorazione di fondo minima. Le identificazioni citometriche a flusso di FAP e MP nel gastrocnemio di ratto sono state eseguite utilizzando la strategia di gating mostrata qui.
I campioni sono stati prima recintati per escludere i detriti nel conteggio delle perle. Le celle sono state quindi chiuse per escludere i doppietti sia dalle caratteristiche di scatter anteriore che da quelle di scatter laterale. La vitalità delle cellule risultanti è stata valutata mediante colorazione con SYTOX Blue.
Le singolette SYTOX Blue negative sono state valutate per CD31 e CD45 per escludere le frazioni di Lin+. La popolazione lin è stata valutata. Le cellule che erano single positive per Sca-1 sono state designate FAPs e le cellule che erano single positive per VCAM-1 sono state designate MP.
Con la co-immunocolorazione immediatamente dopo la cernita, la popolazione appena isolata di FAPs ha mostrato una colorazione positiva per PDGFRalpha senza contaminazione da parte di cellule Pax7 positive. Al contrario, la popolazione ordinata di parlamentari è risultata positiva per Pax7 con un'assenza di cellule PDGFRalpha-positive. I FAP hanno dimostrato fibroblasti e adipociti differenziati al giorno 12 in mezzi di differenziazione adipogenica con espressione rispettivamente della proteina 1 e della perilipina 1 specifiche dei fibroblasti.
La presenza di trigliceridi neutri e lipidi da adipociti maturi era evidente con la colorazione Oil Red O. Inoltre, i FAP hanno dimostrato una presenza di collagene di tipo I e un'assenza di miociti contaminanti. I parlamentari cresciuti in mezzi di differenziazione miogenica il giorno 12 mostravano la presenza di miociti maturi e miotubi multinucleati fusi ed erano privi di fibroblasti e contaminazione degli adipociti.
Quando si utilizza questa tecnica per isolare cellule vive per la coltura a lungo termine, i ricercatori devono assicurarsi di utilizzare la tecnica asettica mentre contemporaneamente lavorano in modo efficiente per garantire una buona vitalità cellulare.
