L'analisi del trascrittoma su singole cellule o tipi di cellule può rilevare la sottile differenza di espressione genica mascherata dall'eterogeneità, che è un potente strumento per scoprire gli elaborati meccanismi di regolazione intracellulare. La selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza seguita dall'analisi RN-seq può essere eseguita in modalità singola cella o bulk cell type con elevata sensibilità di rilevamento della trascrizione e compatibilità con altri approcci multi-omici. Gli utenti per la prima volta di questo protocollo devono prestare attenzione ad alcuni passaggi nell'ordinamento dei protoplasti e nella preparazione della libreria RNA-seq.
Insieme a Jun Zhang, il Dr.Rongrong Xie, un post-doc presso il nostro laboratorio, aiuterà a dimostrare la procedura. Per iniziare, mettere i semi di Arabidopsis thaliana wild type e fluorescent marker line in candeggina al 20% e incubare utilizzando un incubatore rotante a temperatura ambiente per 15 minuti per sterilizzare i semi. Mentre si lavora su una panca sterile, sciacquare i semi da tre a cinque volte in acqua doppia distillata.
Placcare i semi di tipo selvatico e reporter line su mezzo MS a mezza forza con lo 0,8% di peso per volume di agar. Stratificare le piante per due giorni a quattro gradi Celsius. Quindi coltivali verticalmente per cinque giorni a 23 gradi Celsius sotto cicli di luce di 16 ore e buio di 18 ore.
Scongelare delicatamente le soluzioni protoplasting indicate come soluzione A e soluzione B su ghiaccio prima dell'esperimento. Tagliare le radici dalle piante usando una lama pulita o forbici e tagliare le radici in pezzi di circa 0,5 centimetri. Immergere le radici tritate in 1,5 millilitri di soluzione B seguita da una leggera rotazione a temperatura ambiente per 1,5 o 2 ore.
Filtrare i protoplasti radicali risultanti attraverso una rete filtrante da 40 micron e sciacquare la rete con uno o due millilitri di soluzione A.Centrifugare i filtrati combinati a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante usando una pipetta, risospendere il pellet cellulare in 500-600 microlitri di soluzione A e metterlo immediatamente sul ghiaccio. Per la selezione delle celle, trasferire la soluzione di cella risospesa in una nuova provetta da cinque millilitri.
Riempire il serbatoio del liquido della guaina e controllare il serbatoio dei rifiuti. Quindi accendere la selezionatrice cellulare attivata a fluorescenza o la macchina FACS. Eseguire le fasi di configurazione dello strumento e di calibrazione automatica sullo smistatore.
Selezionare i canali di fluorescenza e utilizzare una pianta di tipo selvatico senza fluorescenza come controllo di base. Regolare il gate di ordinamento in base all'intensità della fluorescenza e ai singoletti a dispersione diretta e a dispersione laterale. Dopo aver aggiunto 500 microlitri di soluzione A in un tubo di raccolta da 1,5 millilitri, iniziare a ordinare e raccogliere da 2.000 a 3.000 cellule per tubo.
Dopo la cernita, posizionare immediatamente i campioni sul ghiaccio. Centrifugare la provetta di raccolta contenente le cellule a 300 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti e rimuovere il surnatante con una pipetta. Prendi due microlitri di cellule ordinate e controlla la fluorescenza usando un microscopio a fluorescenza.
Conservare le celle ordinate a meno 80 gradi Celsius se non utilizzate immediatamente. Per l'ordinamento degli indici a cella singola, inserire la piastra a 96 pozzetti con membrana nell'adattatore. Calibrare la posizione della piastra in modo che la goccia cada nel foro centrale della piastra.
Rimuovere la membrana dalla piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra a 96 pozzetti nell'adattatore. Selezionare la modalità di ordinamento a cella singola durante l'ordinamento. Immettere il numero di celle ordinate come una sola e avviare l'ordinamento.
Prima di iniziare l'esperimento, pulire il banco con un decontaminante superficiale e etanolo al 75%. Utilizzare tutte le apparecchiature solo per la preparazione della libreria di sequenziamento. Dopo aver aggiunto un microlitro di miscela A appena preparata nel campione selezionato, macinarlo con un pestello sterile.
Utilizzando acqua priva di RNAsi, portare il volume a 14 microlitri. Quindi trasferire ciascun campione in una provetta PCR a parete sottile da 0,2 millilitri. Quindi preparare la miscela B.Aggiungere 4,4 microlitri nella miscela B a ciascuna provetta PCR contenente campioni e mescolare mediante pipettaggio delicato.
Incubare i campioni a 72 gradi Celsius per tre minuti. Dopo l'incubazione, mettere immediatamente i campioni sul ghiaccio per ibridare l'oligo dT alla coda poli-A. Preparare la miscela di reazione di trascrizione inversa o la miscela C in 21,6 microlitri di essa a ciascuna provetta contenente i campioni.
Sottoporre i campioni a una reazione di trascrizione inversa in uno strumento PCR comune secondo il programma di trascrizione inversa. Aggiungere 40,8 microlitri della miscela di reazione di pre-amplificazione appena preparata o della miscela D al prodotto della reazione di trascrizione inversa ed eseguire il programma di pre-amplificazione. Il ciclo di amplificazione può essere determinato mediante PCR quantitativa quando la reazione entra appena nella fase esponenziale.
Per purificare i prodotti della reazione di pre-amplificazione, trasferire i prodotti preamplificati da un tubo PCR a un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 48 microlitri di perline AMPure XP in ciascun campione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio prima dell'incubazione. Posizionare i tubi da 1,5 millilitri contenenti i campioni e le perline su un supporto di separazione magnetica per cinque minuti.
Scartare con attenzione il surnatante dai campioni senza disturbare le perline. Dopo averli risospesi in 200 microlitri di etanolo all'80%, posizionarli sul supporto di separazione magnetica per altri tre minuti. Dopo aver scartato l'etanolo contenente surnatante, asciugare all'aria i campioni in una provetta per 10 minuti.
Risospendere le perle in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi posizionarli sul supporto di separazione magnetica per cinque minuti. Utilizzando una pipetta, trasferire 18 microlitri di surnatante da ciascuna provetta in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.
Infine, seguire i passaggi descritti nel testo per caratterizzare la pre-biblioteca, seguita dalla costruzione, purificazione e quantificazione della biblioteca. Le linee fluorescenti di marcatori Arabidopsis thaliana sono state sviluppate fondendo proteine fluorescenti con geni espressi specificamente in tipi di cellule bersaglio o utilizzando linee trappola enhancer. I protoplasti marcati specifici per la fluorescenza sono stati ordinati con successo in base all'intensità della fluorescenza e ai singoletti a dispersione diretta e a dispersione laterale.
Le cellule ordinate sono state visualizzate utilizzando l'imaging a campo chiaro e a fluorescenza. Vengono mostrati i risultati rappresentativi della libreria di sequenziamento dell'RNA di circa 2.000 cellule del periciclo del polo xilematico, cellule primordiali della radice laterale, cellule dell'endoderma o della corteccia e cellule del cappuccio radicale laterale. Una libreria di piccole dimensioni con picchi di dimero di primer o adattatore può ancora essere sequenziata dopo la selezione delle dimensioni.
Una libreria con una distribuzione delle dimensioni anomala indicava una preparazione della libreria non riuscita. Sono stati analizzati i modelli di espressione genica. I geni arricchiti in uno qualsiasi dei quattro tipi di cellule radice sono stati raggruppati e rappresentati in una mappa di calore che mostra la specificità delle espressioni geniche tra diversi tipi di cellule.
L'alta qualità e la purezza delle cellule bersaglio attraverso il corretto gating e la selezione e la prevenzione della degradazione dell'RNA sono fondamentali per il successo della costruzione della libreria. Per l'RNA-seq in modalità singola cellula, sono stati recentemente descritti diversi metodi integrati con l'identificatore molecolare univoco che hanno migliorato significativamente le prestazioni.
