Isolamento di frazioni mitocondriali arricchite da colture cellulari e campioni di tessuto di piccoli animali per saggi di attività su gel

Per iniziare, risospendere il pellet di cella impaccato in un volume di tampone ipotonico pari a sette volte il volume del pellet di cella. Trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore Potter-Dounce e incubare su ghiaccio per due minuti, lasciando che le cellule si gonfino. Rompere le membrane cellulari eseguendo da 8 a 10 colpi nell'omogeneizzatore accoppiato a un pestello in teflon azionato a motore che ruota a 600 giri/min.

Aggiungere un volume uguale di tampone ipertonico alla sospensione cellulare per generare un ambiente isotonico. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 10 a 15 millilitri. Centrifugare a 1.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in una provetta di polipropilene da 1,5 millilitri.

Per raccogliere la frazione grezza mitocondriale, centrifugare in una microfuga a 16.000 G per due minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet arricchito con mitocondri con 0,5 millilitri di tampone A.Combinare il contenuto di due provette in una sola e centrifugare come dimostrato in precedenza. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone A.Quantificare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il saggio Bradford.

Usando le forbici, taglia i 20-30 milligrammi di tessuto animale. Lavare il fazzoletto tre o quattro volte nel tampone di omogeneizzazione con l'aiuto di un colino, facendo attenzione a non perdere i pezzi più piccoli. Trasferire i pezzi di tessuto con il tampone nell'omogeneizzatore.

Per i tessuti del fegato, della milza e dei reni, eseguire da quattro a sei colpi su e giù nell'LVM Potter con un pestello in teflon azionato a motore a 600 giri/min.