Analisi dei supercomplessi mitocondriali nelle frazioni tissutali dei mammiferi tramite saggi di attività in-gel

Iniziare risospendendo le frazioni mitocondriali ottenute da colture cellulari di mammiferi o tessuti in tampone nativo blu per ottenere una concentrazione proteica di circa 10 milligrammi per millilitro. Per solubilizzare le membrane mitocondriali, aggiungere digitonina per ottenere un rapporto di quattro grammi di digitonina per grammo di proteina mitocondriale. Mescolare con un pipettaggio delicato e incubare su ghiaccio per cinque minuti.

Centrifugare la sospensione in microfuga a 20.000 G per 25 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere il materiale insolubile. Raccogliere il surnatante in una provetta nuova, quindi aggiungere il 5% di Coomassie blue G-250, equivalente a un terzo del volume di risospensione iniziale, e mescolare pipettando. Aggiungere il tampone del catodo freddo A nella camera superiore dell'apparecchio di elettroforesi e il tampone anodico nella camera inferiore.

Caricare da 30 a 100 microgrammi di proteina mitocondriale nei pozzetti su un gel di poliacrilammide. Dopo l'elettroforesi, posizionare il gel in una scatola di plastica. Aggiungere un volume sufficiente di soluzione appropriata per il saggio di attività del gel per coprire il gel e incubare a temperatura ambiente agitando delicatamente, proteggendo dalla luce.

Quando si sono sviluppate le bande appropriate, rimuovere la soluzione di dosaggio. Lavare il gel due volte con acqua distillata prima di fissarlo con il 40% di metanolo e il 10% di acido acetico per 30 minuti. L'analisi del saggio dell'attività del gel ha rivelato distinti modelli di assemblaggio del super complesso nei topi e nelle cellule umane.

Il complesso libero 1 è stato osservato nelle cellule di topo, mentre non era rilevabile nei mitocondri umani. I modelli del complesso 4 erano simili nelle linee cellulari umane, ma variavano nelle linee cellulari di topo a causa di una variante mutante di SCAF1.