Per iniziare, procurati un topo SMARTA positivo CD 45.1 di sei-otto settimane e iniettalo con 200 microgrammi di peptide LCMV GP 61-77 in 100 microlitri di terreno RPMI per via endovenosa. Dopo aver acquisito gli splenociti dal topo, sospenderli al 2% di RPMI per ottenere una densità cellulare di una volta 10 per le cellule T per millilitro e posizionare la provetta con le cellule sul ghiaccio. Erogare 50 microlitri di sospensione cellulare insieme a 150 microlitri di tampone di colorazione in ciascun pozzetto di una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti.
Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 800 G per un minuto a quattro gradi Celsius e decantare accuratamente il surnatante. Agitare la piastra e aggiungere 200 microlitri di tampone colorante a ciascun pozzetto. Dopo aver pellettato le cellule, risospenderle e incubarle con un cocktail di anticorpi superficiali su ghiaccio per 30 minuti al buio.
Dopo aver lavato due volte, risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone colorante e trasferirle in una provetta per citometria a flusso. Eseguire l'analisi della citometria a flusso per verificare lo stato di attivazione delle cellule T CD4 positive di Smarta. Quindi seminare una volta 10 le sei cellule T positive SMARTA CD4 per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti.
Centrifugare le cellule a 800 G per tre minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con cura il mezzo surnatante. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno retrovirale e otto microgrammi di polibrene a ciascun pozzetto. Spin trasdurre le celle a 800 G per due ore a 37 gradi Celsius.
Dopo aver scartato il terreno del retrovirus, incubare le cellule con un millilitro di RPMI preriscaldato al 10% integrato con interleuchina 2. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugarla. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule con il 2% di RPMI per ottenere una densità cellulare di una volta 10 per l'ottavo di cellule per millilitro.
Per valutare l'efficienza di trasduzione, aliquotare 50 microlitri di sospensione cellulare in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti. Incubarli su ghiaccio con il cocktail di anticorpi di superficie che include CD4, V alfa due e anticorpi associati al tag vettore. Lavare le cellule ed eseguire la citometria a flusso come dimostrato in precedenza.
Quindi, iniettare una volta 10 delle sei cellule T CD4 positive SMARTA CD4 positive CD 45.1 a un topo ricevente C57BL/6 per via endovenosa, seguite da una volta 10 alle sei unità formanti la placca di LCMV Armstrong il giorno successivo. Dopo aver acquisito gli splenociti dal topo, colorarli per controllare i marcatori desiderati. Per rilevare i fattori trascrizionali, incubare le cellule con 200 microlitri di paraformaldeide al 2% a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
Infine, eseguire la citometria a flusso per rilevare i fattori nella fase precoce dell'infezione acuta da LCMV. Il terzo giorno dopo l'infezione, è stata riscontrata una biforcazione bilanciata delle cellule T helper follicolari e delle cellule T-helper 1 Tra le cellule T CD4 positive per MIGR1 SMARTA. Una differenziazione predominante delle cellule T helper follicolari ausiliarie e livelli di espressione di BCL6 aumentati sono stati osservati nelle cellule T CD4 MIGR1 BCL6 SMARTA.
