Per iniziare, acquisisci le immagini delle sezioni di HCC immunocolorate. Scarica e apri QuPath 0.4.3. exe sul computer.
Crea una nuova cartella con un nome adatto per l'organizzazione dei progetti QuPath. Fare clic sul pulsante Crea progetto nell'angolo in alto a sinistra del software e selezionare la cartella appena creata. Quindi trascina le immagini scansionate nella finestra del software QuPath.
Quando viene visualizzata una nuova finestra, selezionare Imposta tipo di immagine e fare clic su H-DAB, quindi su Importa. Per visualizzare le immagini importate, controlla l'elenco nella finestra di sinistra del menu e fai doppio clic su un'immagine per aprirla. Seleziona il file dal menu principale e procedi con il salvataggio delle immagini come progetto.
Scegli gli strumenti pennello o bacchetta nel menu principale per annotare l'area del tumore. In caso di regioni tumorali discontinue, annotare ciascuna regione separatamente. Tenere premuto il tasto Ctrl mentre si selezionano tutte le regioni.
Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere modifica multipla e selezionare Unisci selezionati. Successivamente, fai clic su automatizza nel menu principale e seleziona Mostra editor di script. Copia lo script richiesto, incollalo nell'editor di script, quindi fai clic su Esegui.
In alternativa, selezionare lo strumento polilinea dal menu principale per disegnare con precisione un bordo, separando i nidi di cellule maligne e il tessuto non tumorale adiacente. Quindi seleziona il bordo dal menu principale, scegli gli oggetti, fai clic su annotazione e seleziona Espandi annotazioni. Impostare il raggio di espansione su 500 micrometri e scegliere piatto per il cappuccio della linea.
Attivate l'opzione Rimuovi interno e assicuratevi che l'opzione Vincola all'elemento padre sia attivata. Ora fai clic con il pulsante destro del mouse sull'annotazione appena creata. Seleziona Modifica singolo e scegli Dividi.
Per denominare correttamente le regioni annotate, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'annotazione nell'elenco a sinistra. Selezionare Imposta proprietà e immettere i nomi appropriati per le regioni del margine interno ed esterno. Definire l'area tumorale rimanente come centro del tumore.
Estendere l'area peritumorale larga 500 micrometri adiacente al margine esterno come dimostrato in precedenza. Per un'analisi dettagliata dei pixel, selezionare lo strumento rettangolo dal menu principale. Quindi annota una regione, comprendendo tutti i tipi di pixel da distinguere.
Quindi, vai al menu principale. Selezionare Analizza e fare clic su Pre-elaborazione. Quindi fare clic su stima vettore macchia.
Dopo aver attivato l'editor visivo delle macchie, seleziona auto e fai clic su OK. Assegna un nome al vettore di colorazione stimato H-DAB. Per l'analisi dei pixel, un metodo alternativo prevede l'utilizzo dello strumento rettangolo dal menu principale per evidenziare una piccola sezione di un nucleo colorato con ematossilina.
Successivamente, accedi al menu a sinistra e seleziona l'immagine. Quindi fare doppio clic sulla macchia uno e selezionare Sì. Anche in questo caso, utilizzare lo strumento rettangolo per annotare una piccola regione, che mostra una colorazione positiva con DAB.
Successivamente, seleziona l'immagine dal menu a sinistra e fai doppio clic sulla macchia due, seguita da sì. Per valutare la frazione di area delle cellule immunitarie positive dal menu principale, fare clic sull'opzione di classificazione, selezionare la classificazione dei pixel e fare clic su crea soglia. Successivamente, impostare la risoluzione su alta, selezionare il canale DAB e applicare un prefiltro gaussiano con un sigma di 0,5.
Regolare la soglia tra 0,2 e 0,3. Definite i pixel sopra la soglia come positivi e quelli sotto soglia come negativi. Per la selezione della regione, optare per qualsiasi annotazione.
Assegnare un nome al classificatore. Quindi fai clic su Salva, misura e va bene. Per documentare i risultati, copia i risultati visualizzati nel menu a sinistra e trasferiscili in un foglio di calcolo.
Seleziona misura dal menu principale in alto come metodo alternativo. Quindi scegli mostra misure annotazione. Seleziona Copia negli appunti e incolla questi risultati in un foglio di calcolo per un record dettagliato.
Infine, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine, vai alla visualizzazione multipla e fai clic su Chiudi visualizzatore per chiudere l'immagine. La proteina CD117 è stata osservata prevalentemente nelle membrane citoplasmatiche delle cellule arrotondate nello stroma tumorale e negli spazi paravascolari. Le cellule CD117-positive sono state osservate anche nelle capsule tumorali e nelle aree paravascolari del margine esterno e del paratumore.
La proteina NKp46 è stata osservata principalmente nelle membrane citoplasmatiche di cellule arrotondate in spazi sinusoidi, nello stroma del centro tumorale e nel margine interno. Le cellule Nkp46-positive sono state osservate nelle capsule attorno ai nidi tumorali e nello stroma dei tratti portali nel margine esterno e nelle regioni peritumorali. La proteina CD1a è stata osservata principalmente nelle membrane citoplasmatiche delle cellule arrotondate, sparse o in aggregati nello stroma e negli spazi sinusoidi nel centro del tumore e nelle regioni del margine interno.
Le cellule CD1a-positive sono state trovate nei sinusoidi e nell'epitelio biliare nella regione del paratumore.
