Per iniziare, metti una fiala di cellule mononucleate del sangue periferico umano crioconservate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelata, trasferire la sospensione di PBMC in una provetta da 15 millilitri contenente nove millilitri di TGM. Centrifugare la provetta a 300 G per cinque minuti dopo aver pipettato un'aliquota della sospensione cellulare per il conteggio.
Risospendere il PBMC pellettato in tre millilitri di TGM. Quindi, trasferire il volume richiesto di sospensione cellulare in una piastra a sei pozzetti. Il giorno prima della rianimazione cellulare, trasferire 100 microlitri di microsfere magnetiche di immunoglobulina G di topo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Aggiungere un millilitro di PBS ai tubi e posizionarli su un supporto magnetico per lavare le perline. Risospendere le perle in 100 microlitri di PBS. Quindi aggiungere gli anticorpi alla sospensione.
Utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente la sospensione. Posizionare la sospensione su un bilanciere a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver lavato le perle in PBS come fatto in precedenza, risospenderle in 100 microlitri di PBS.
Aggiungere ora le microsfere immunoimetriche rivestite con NHCD3 hCD28 alla piastra e incubare. Dopo 48 ore di incubazione, miscelare e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Posizionare il tubo su un supporto magnetico per tre minuti.
Quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 15 millilitri. Seminare cinque volte 10 alla potenza di cinque PBMC in 300 microlitri di TGM nei pozzetti di una piastra piana a 48 pozzetti. Pipettare 200 microlitri di brodo lentivirale nei pozzetti corrispondenti.
Quindi aggiungere il solfato di protamina a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro prima della centrifugazione. Pipettare 300 microlitri di surnatante da ogni pozzetto, quindi aggiungere un millilitro di TGM fresco in ogni pozzetto. Posizionare la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica.
Aggiungere 0,5-2 millilitri di TGM freschi al piatto ogni due o tre giorni. Quindi trasferire le cellule in una piastra a 12 pozzetti, seguita da una piastra a sei pozzetti fino a quando la densità totale delle celle raggiunge i 6 milioni in un volume di quattro millilitri.
