Per iniziare, piastrate le cellule T trasdotte da CAR in coltura in due piastre da 12 pozzetti contenenti due millilitri di TGM. Metti una piastra direttamente in un incubatore umidificato sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Posizionare l'altra piastra in una camera mobile dell'incubatore di anidride carbonica, ossigeno e azoto con il livello di ossigeno preimpostato all'1%Raccogliere 500.000 cellule dalle piastre ogni 24 ore in entrambe le condizioni in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Centrifugare le provette a 500 G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, pipettare delicatamente un millilitro di PBS nel pellet cellulare. Risospendere le cellule pellettate in 50 microlitri di tampone FACS.
Quindi aggiungere 50 microlitri di una diluizione da uno a 100 di anticorpo anti-flag coniugato con ficoretrina. Pipettare la sospensione per miscelare accuratamente. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone FACS a ciascuna provetta.
Centrifugare la sospensione miscelata a 500 G per cinque minuti. Ora, pipettare i surnatanti da ogni provetta. Quindi risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone FACS.
Trasferire la sospensione cellulare risultante in provette per citometria a flusso da cinque millilitri. Eseguire la citometria a flusso sulla sospensione cellulare per determinare l'espressione del recettore dell'antigene chimerico di superficie. Imposta nuovi tubi come vuoti e CAR.
Fare clic sui canali FSCA, FSCH, SSCA, SSCH, PE e FITC. Quindi crea quattro grafici a dispersione per identificare in sequenza singole cellule, cellule viventi, cellule GFP positive e PE positive. Imposta i parametri per la raccolta di 10.000 singole cellule viventi.
Fare clic su Acquisisci dati. Dopo che la raccolta delle celle è stabile, fare clic su registra dati. Per determinare la posizione dei gate in base al controllo negativo, gate le cellule positive per EGFP e ficoeritrina per misurare la positività alla ficoeritrina e l'intensità mediana della fluorescenza.
Il CAR bersaglio sensibile all'ipossia per due ha mostrato espressioni significativamente elevate di CAR in condizioni ipossiche rispetto alle condizioni normossiche.
