Per iniziare, seminare 1000 cellule bersaglio in ciascun pozzetto di due piastre di coltura tissutale a fondo piatto da 96 pozzetti contenenti 200 microlitri di FBSDMEM. Il giorno successivo pipettare con cura 100 microlitri di surnatante dalla parte superiore di ogni pozzetto. Aggiungere cellule T chimeriche del recettore dell'antigene o cellule T non trasdotte in 100 microlitri di FBSDMEM a diversi rapporti.
Posizionare una piastra in un'atmosfera di ossigeno al 21% e l'altra in una camera di incubazione mobile di ossigeno e azoto ad anidride carbonica in un'atmosfera di ossigeno all'1%. Dopo 24 ore di co-coltura, utilizzare una pipetta per trasferire con cura tutto il surnatante in una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U. Conservare il surnatante a meno 20 gradi Celsius per il rilevamento delle citochine.
Ora aggiungere 60 microlitri di tampone di lisi passiva in ogni pozzetto sperimentale delle piastre nere a fondo piatto da 96 pozzetti. Posizionare le piastre su uno shaker per 30 minuti per garantire un'efficiente lisi cellulare. Aggiungere 60 microlitri di substrato di luciferasi di lucciola in ogni pozzetto sperimentale.
Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare immediatamente l'attività della luciferasi. Infine, calcolare la percentuale di citotossicità normalizzata con l'equazione data. Il CAR HER2 sensibile all'ipossia è stato in grado di uccidere efficacemente le cellule bersaglio indipendentemente dal fatto che l'atmosfera fosse ipossica o normossica.
Al contrario, le cellule CAR T HER2-BBz-ODD hanno mostrato una citotossicità significativamente più debole in condizioni normossiche per tutte le condizioni.
