Per iniziare, ottenere cellule leucemiche coltivate in condizioni ottimali per il trapianto. Dopo aver contato le cellule, pellettare a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Per la colorazione CM-Dil, risospendere le cellule nella soluzione di lavoro per ottenere una volta 10 alla potenza di sei cellule in 100 microlitri e incubarle a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Lavare le celle due volte con 10 millilitri di 1X HBSS a temperatura ambiente. Dopo aver pellettato le celle a 300 g per cinque minuti, risospenderle in PBS contenente l'1% di FBS per ottenere una densità di 40.000 cellule per microlitro. Quindi accendere il micro iniettore e la pompa.
Impostare la pressione di iniezione da nove a 11 libbre per pollice quadrato e il tempo di iniezione a 0,5 secondi per agganciare l'ago e impostare l'orifizio. Caricare con cautela circa cinque microlitri della linea di sospensione delle cellule tumorali nel microago, in un unico passaggio, evitando la formazione di bolle d'aria. Utilizzando una pinza Dumont 5, tagliare l'estremità dell'ago per produrre un orifizio in grado di supportare l'espulsione.
Quindi selezionare gli embrioni sani di zebrafish al microscopio, eliminando quelli con anomalie dello sviluppo. Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, prelevare gli embrioni anestetizzati e disporne da 10 a 15 in posizione laterale sulla piastra di agarosio all'1,5%. Rimuovere l'acqua in eccesso per lasciare una quantità minima per la sopravvivenza dell'embrione.
Quindi, conferma al microscopio ottico che l'ago sia tagliato bene e abbia le cellule. Iniettare da 10 a 15 nanolitri corrispondenti a 400-600 cellule nel tuorlo degli embrioni per 0,2-0,3 secondi. Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, raccoglierli in acqua fresca per embrioni.
Un'ora dopo l'iniezione, monitorare il bolo delle cellule per separare gli embrioni con colorazione ottimale o buon bolo da quelli con colorazione inferiore o bolo inferiore. La colorazione CM-Dil e la marcatura fluorescente delle proteine hanno permesso il monitoraggio della progressione della malattia mediante microscopia. E la sopravvivenza degli embrioni è diminuita dopo l'iniezione con due linee di leucemia geneticamente distinte.
