Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R37AI110985 e P30CA006927, uno stanziamento del Commonwealth della Pennsylvania, della Leukemia and Lymphoma Society e del Bishop Fund. Questo studio è stato supportato anche dalle strutture principali di Fox Chase, tra cui la coltura cellulare, la citometria a flusso e la struttura per animali da laboratorio. Ringraziamo la dottoressa Jennifer Rhodes per aver mantenuto la struttura di zebrafish e microiniezione presso FCCC.

Il mantenimento, l'alimentazione e l'allevamento del pesce zebra sono avvenuti in condizioni di acquacoltura standard a 28,5 °C, come descritto31. Tutti gli esperimenti relativi al pesce zebra sono stati fatti a questa temperatura; tuttavia, dopo lo xenotrapianto, gli animali sono stati coltivati a 34 °C per tutta la durata dell'esperimento, in conformità con le procedure approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC).
1. Allevamento (3 giorni prima dell'iniezione)
<ol><li>Fornire mangime secco (mangime extra; 5-6 granuli per pesce) alle coppie di pesci una settimana prima della riproduzione per massimizzare la salute degli animali e aumentare il numero di embrioni prodotti dalle coppie riproduttrici.</li>
	<li>La sera prima del prelievo degli embrioni, sistemare gli animali riproduttori in vasche di riproduzione con un divisorio che separa i pesci maschi e femmine, utilizzando accoppiamenti harem di 2 femmine per ogni maschio. NOTA: Per esperimenti con 4 braccia di 100 animali per braccio, impiegare 20 coppie riproduttive per esperimento. Per determinare il numero di coppie riproduttive necessarie, una buona stima è di 50 embrioni per coppia riproduttiva casper . Un'altra opzione è quella di utilizzare un ceppo di pesce zebra più robusto e pigmentato e trattare con 1-fenil 2-tiourea (PTU) per prevenire la pigmentazione31. In pratica, l'esperimento dovrebbe essere ridimensionato in modo tale da avere abbastanza embrioni per iniettare il doppio del numero desiderato a 1 giorno dopo l'iniezione (dpi).</li>
</ol>2. Raccolta degli embrioni (2 giorni prima dell'iniezione)
<ol><li>La mattina dopo, rimuovere i divisori, permettendo ai pesci di riprodursi.</li>
	<li>Visualizzare gli embrioni nelle vasche 20 minuti (min) dopo aver rimosso i divisori.</li>
	<li>Raccogli gli embrioni usando un setaccio in una capsula di Petri da 90 mm contenente acqua per embrioni fatta come descritto nel Libro del pesce zebra31.<ol><li>Per preparare l'acqua dell'embrione, aggiungere 1,5 ml di sali di riserva a 1 litro di acqua distillata e blu di metilene allo 0,1% finale. Preparare la soluzione salina brodo sciogliendo 40 g di sali marini (Tabella dei materiali) in 1 L di acqua distillata. La composizione ionica dell'acqua embrionale è K+ (0,68 mg/L), Cl− (31,86 mg/L), Na+ (17,77 mg/L), SO4− (4,47 mg/L), Mg2+ (2,14 mg/L) e Ca2+ (0,68 mg/L).</li>
	</ol></li>
	<li>Lasciate che il pesce zebra si riproduca per un'ora in più e raccogliete gli embrioni risultanti.</li>
	<li>Raggruppa gli embrioni per l'esperimento.</li>
	<li>La sera, rimuovere tutti gli embrioni non fecondati o morti, che sono riconoscibili per la loro morfologia anormale, e fornire acqua fresca agli embrioni.</li>
</ol>3. Mantenimento dell'embrione e preparazione degli strumenti per le iniezioni (1 giorno prima dell'iniezione)
<ol><li>La mattina seguente, rimuovi eventuali embrioni morti e fornisci acqua fresca agli embrioni.</li>
	<li>Preparare una piastra di agarosio riscaldando l'1,5% di agarosio in acqua embrionale e versare la miscela riscaldata in una piastra Petri da 90 mm. Una piastra da 90 mm richiede 30-35 ml di miscela.</li>
	<li>Estrarre gli aghi non filamentosi dai capillari di vetro (borosilicato) utilizzando l'estrattore dell'ago. Gli aghi vengono tirati (sotto pressione termica) producendo un'estremità chiusa; Agganciali con una pinza per generare un orifizio ottimale. Valutare l'idoneità dell'orifizio dell'ago determinando il volume di fluido spostato per unità di tempo (vedere sotto, paragrafo 6.3). NOTA: I capillari in vetro possono essere acquistati con o senza filamenti centrali. I capillari privi di filamenti centrali sono preferiti per le iniezioni cellulari.</li>
	<li>Posizionare gli aghi in una piastra di Petri coperta da 90 mm nelle scanalature realizzate con l'argilla (argilla da modellare per bambini) fino all'uso (Figura 2A).</li>
</ol>4. Preparazione ed etichettatura delle cellule leucemiche con CM-Dil (giorno dell'iniezione)
<ol><li>Mantenere le cellule da trapiantare in condizioni ottimali per la loro crescita. Le cellule di leucemia murina qui impiegate erano sufficienti (M82; Rpl22+/+) o carente (M109; Rpl22-/-) per la proteina ribosomiale Rpl22, che funziona come soppressore tumorale32.</li>
	<li>Celle a pellet in provetta conica da 50 mL. Contare, quindi centrifugare a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Scartare il surnatante. NOTA: Il numero di celle necessarie sarà dettato dall'ambito e dalle condizioni sperimentali, ma 1 x 106 celle è un buon punto di partenza.</li>
	<li>Eseguire la colorazione CM-Dil NOTA: La colorazione CM-Dil consente il monitoraggio del bolo di iniezione.<ol><li>Preparare una soluzione madre di CM-Dil risospendendo un flaconcino da 50 μg di CM-Dil in 50 μL di dimetilsolfossido (DMSO; 1 mg/mL o ~1 mM finale).</li>
		<li>Produrre una soluzione di lavoro diluendo il brodo (4,8 μL di colorante/mL) in siero fetale bovino all'1% (FBS)/soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente eventuali integratori di supporto necessari alle cellule da utilizzare.</li>
	</ol></li>
	<li>Risospendere le cellule a 1 x 106/100 μL nella soluzione di lavoro del colorante.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 10 min. NOTA: Le condizioni di colorazione devono essere ottimizzate per le celle impiegate (tempo, ecc.). Le cellule utilizzate qui hanno richiesto due distinte incubazioni di 10 minuti a temperature diverse per ottenere una colorazione ottimale.</li>
	<li>Lavare con 10 ml di 1x HBSS a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Cellule a pellet (centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a RT), decantare il surnatante, quindi risospendere con 10 mL di HBSS e ripetere lo stesso per un secondo lavaggio.</li>
	<li>Risospendere le cellule tumorali colorate a 40.000 cellule/μL in FBS/PBS all'1% e in qualsiasi integratore di supporto necessario e mantenere la sospensione cellulare a 34 °C fino all'iniezione. NOTA: Sono stati necessari integratori di supporto per il mantenimento delle linee cellulari utilizzate in questo studio (ad esempio, FBS all'1% e citochine). Gli integratori e gli xenotrapianti potrebbero dover essere adattati alle particolari linee cellulari in studio. La PBS è stata selezionata qui al posto dei terreni per evitare qualsiasi potenziale tossicità nel tuorlo.</li>
</ol>5. Dechorionation
<ol><li>Dechorionare manualmente gli embrioni di pesce zebra casper a 2 dpf utilizzando siringhe per iniezione di insulina con ingrandimento 2x in un microscopio ottico. Forare il corion con un ago mentre si usa l'altro ago per immobilizzare il corion. NOTA: L'uso della pronasi per la decorionazione non è raccomandato perché a volte provoca una riduzione della salute dell'embrione. La decelerazione degli embrioni a 2 dpf è preferibile perché è più facile e gli embrioni sono meno fragili rispetto ai tempi precedenti (1 dpf).</li>
	<li>Durante la decorionazione, fare attenzione a non toccare gli embrioni con gli aghi. Toccare o danneggiare il tuorlo degli embrioni mediante il contatto involontario con gli aghi potrebbe causare la morte.</li>
	<li>Rimuovere i corioni spogliati cambiando l'acqua dell'embrione.</li>
</ol>6. Impostazione del microiniettore e dell'ago
<ol><li>Accendere il microiniettore e la pompa e creare le condizioni adatte per le microiniezioni di cellule. Una pressione di iniezione di 9-11 psi e un tempo di iniezione di 0,5 secondi (s) sono un buon punto di partenza per agganciare l'ago e impostare l'orifizio.</li>
	<li>Caricare con cura la sospensione della linea cellulare tumorale (~5 μL) nel microago in un unico passaggio, evitando la formazione di bolle d'aria, che interromperanno il flusso cellulare all'interno dell'ago.</li>
	<li>Tagliare l'estremità dell'ago con una pinza (numero di Dumont 5) per produrre un orifizio che supporterà l'espulsione di 10-15 nanolitri (nL) di sospensione cellulare per 0,2-0,3 s. NOTA: Il calcolo di cui sopra del volume nL viene eseguito utilizzando capillari di calibrazione, dove 1 mm = 30 nL. In breve, impostare il tempo a 0,5 s e, dopo ogni clip dell'ago, premere inietta e raccogliere il volume nel capillare di calibrazione. Quindi, la lunghezza del volume raccolto viene misurata utilizzando la scala al microscopio e il taglio dell'ago viene interrotto quando vengono iniettati 30 nL in 0,5 s. Quindi, impostare il tempo delle iniezioni su 0,2-0,3 s. (iniettando ~10-15 nL di cellule)</li>
</ol>7. Preparazione dell'embrione per l'iniezione
<ol><li>Seleziona gli embrioni sani al microscopio, eliminando quelli con anomalie dello sviluppo come edema cardiaco o un tronco corto o curvo.</li>
	<li>Anestetizzare gli embrioni utilizzando tricaina metansolfonato (MS-222; 0,16 g/L di acqua embrionale) per 1 minuto in una piastra di Petri da 90 mm.</li>
	<li>Usa una pipetta di vetro Pasteur per raccogliere gli embrioni. Disporre 10-15 embrioni in posizione laterale sulla piastra di agarosio all'1,5% (Figura 2B-D).</li>
	<li>Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando la pipetta Pasteur, lasciando la quantità minima di acqua per embrioni necessaria per mantenere in vita gli embrioni.</li>
</ol>8. Procedura di iniezione
<ol><li>Controllare al microscopio ottico per assicurarsi che le cellule si siano accumulate nella punta dell'ago.</li>
	<li>Iniettare gli embrioni utilizzando l'ago calibrato per 0,2-0,3 s (con 10-15 nL corrispondenti a 400-600 cellule) nel tuorlo degli embrioni.</li>
	<li>Ripetere l'iniezione per tutti gli embrioni, quindi raccoglierli in acqua fresca per embrioni. NOTA: Poiché le cellule tendono ad accumularsi sulla punta dell'ago, la punta dovrà essere riagganciata leggermente ogni 15-20 iniezioni. Ciò richiederà anche il ripristino della pressione e del tempo ad ogni ritaglio per garantire che venga iniettato un volume simile.</li>
	<li>Per assicurarsi che il confronto del comportamento di due set distinti di cellule trasferite sia valido, monitorare il bolo delle cellule trasferite. A tale scopo, selezionare gli embrioni in base alla colorazione CM-Dil (nel canale RFP) a 1 ora dopo l'iniezione (hpi), separando quelli con colorazione ottimale ("bolo buono") da quelli con colorazione inferiore ("bolo inferiore"; Figura 3, freccia gialla).</li>
	<li>Scartare gli embrioni con un bolo inferiore o utilizzarli per valutare l'impatto di una diversa dose di cellule sulla progressione della malattia.</li>
	<li>Rimuovere gli embrioni morti entro la fine della giornata poiché la loro morte è correlata a un trauma da iniezione piuttosto che alla crescita del tumore. Rimuovere dall'analisi gli embrioni che non trattengono le cellule poiché le cellule probabilmente sono fuoriuscite dal sito di iniezione.</li>
	<li>Mantenere gli embrioni iniettati a 34 °C per tutta la durata dell'esperimento in una piastra da 90 mm con ~60 embrioni per piastra. NOTA: Dopo 5 dpf, il tuorlo sarà stato consumato dagli embrioni in crescita, quindi agli embrioni deve essere fornito cibo paramecium per tutta la durata dell'esperimento. Per garantire una corretta nutrizione, i parameci devono essere somministrati agli embrioni ogni giorno da 6 dpf (4 dpi) a 9 dpf (7 dpi). I parameci si propagano per coltura in fiaschi in condizioni ottimali di nutrizione e temperatura, come descritto31.</li>
</ol>9. Analisi di sopravvivenza
<ol><li>Monitora gli embrioni per i successivi 7 dpi, cambiando l'acqua dell'embrione ogni giorno. I cambi d'acqua possono essere ridotti a giorni alterni per comodità se lo studio prevede un trattamento farmacologico.</li>
	<li>Controllare la salute dell'embrione e valutare la morte per tutta la durata dell'analisi. NOTA: La durata dell'esperimento è stata di 7 giorni per questo esperimento, ma può essere più breve o più lunga a seconda dell'aggressività del tumore xenotrapiantato.</li>
	<li>Utilizzare la fluorescenza CM-Dil per valutare il carico di malattia (Figura 4A) e determinare l'impatto delle alterazioni genetiche o dei trattamenti farmacologici sulla sopravvivenza utilizzando l'analisi Kaplan Meier e la rappresentazione grafica (ad esempio, con GraphPad Prism; Figura 4B) 33.</li>
</ol>10. Sospensione di embrioni su singola cellula per analisi di citometria a flusso
NOTA: Il carico di malattia può essere valutato mediante analisi di citometria a flusso dopo xenotrapianto; Tuttavia, per farlo è necessaria una marcatura indelebile delle cellule tumorali. La proteina fluorescente rossa (RFP) o mCherry consegnata retrovialmente o lentiviralmente è efficace in quanto fornisce un buon segnale sull'autofluorescenza delle cellule di zebrafish, che oscura il segnale della proteina fluorescente verde.
<ol><li>Isolare gli embrioni allo stadio dpi di scelta. Qui viene visualizzato 5 dpi (Figura 5).</li>
	<li>Raccogli 30-40 embrioni per condizione come punto di partenza, ma il numero di embrioni può variare a seconda dello stadio e dell'aggressività delle cellule trapiantate. Anestetizzare gli embrioni come descritto sopra. NOTA: Gli embrioni possono essere suddivisi in repliche per fornire una significatività statistica, come mostrato qui (Figura 5B).</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in provette da centrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Utilizzare 100 μl di soluzione di Ringer priva di calcio (ricetta31) per campione per sciogliere il tuorlo poiché il basso contenuto di calcio ammorbidisce i tessuti embrionali, consentendo una dissociazione tissutale più efficace.</li>
	<li>Pipettare su e giù a intermittenza per 5 minuti per rimuovere il tuorlo utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl.</li>
	<li>Preriscaldare lo 0,05% di tripsina/PBS (senza indicatore rosso fenolo) a 29 °C e integrarlo con 27 μL di collagenasi IV (100 mg/mL) per mL di soluzione di tripsina. Sarà necessario un volume di 1 mL di soluzione per ogni campione di embrioni.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/collagenasi a ciascun campione di embrioni detuolati e incubare a 29 °C per 30-35 minuti.</li>
	<li>Pipettare gli embrioni su e giù in questa soluzione utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml ogni 5 minuti fino a quando la struttura degli embrioni (spina dorsale) non è più visibile.</li>
	<li>Arrestare la reazione utilizzando 200 μL di FBS.</li>
	<li>Mescolare bene e incubare a 29 °C per altri 5 minuti per garantire la completa inattivazione della tripsina. NOTA: Una temperatura di 29 °C viene impiegata per il protocollo di dissociazione tissutale per prevenire la morte indotta dallo shock termico delle cellule di zebrafish, che si verifica a 37 °C; tuttavia, se non è richiesta la conservazione delle cellule di zebrafish, la digestione può essere eseguita a 37 °C.</li>
	<li>Pellettare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet della cella in PBS a 4 °C e il pellet come sopra.</li>
	<li>Ripetere il lavaggio, quindi filtrare le cellule attraverso un colino da 70 μm.</li>
	<li>Pellet e procedere con la colorazione per l'analisi di citometria a flusso. NOTA: Se è necessaria la coltura di cellule primarie di zebrafish, lavare altre due volte con PBS a 4 °C e risospendere in terreno L15 (con antibiotici e FBS al 10%).</li>
</ol>11. Selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS): colorazione e selezione di cellule xenotrapiantate
<ol><li>Risospendere la sospensione cellulare in un mezzo di colorazione (HBSS con FBS all'1%) e pellettare a 300 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di colorazione con un anticorpo reattivo con le cellule trapiantate per fornire un secondo marcatore (oltre a RFP o mCherry) con cui distinguere le cellule trapiantate dalle cellule di zebrafish. In questo caso, sono stati impiegati 50 μL di CD45 anti-topo (APC-CD45) per campione a una diluizione di 1:50 (Figura 5).</li>
	<li>Incubare per 20 minuti a 4 °C prima di lavare come sopra con 1 mL di mezzo colorante per rimuovere l'anticorpo non legato.</li>
	<li>Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 200 μl di mezzo di colorazione contenente il colorante vitale Helix NP Blue (1 μM), che consentirà la distinzione vivo/morto.</li>
	<li>Trasferire la miscela cellulare in provette in policarbonato a fondo tondo da 5 mL per l'analisi della citometria a flusso. NOTA: La colorazione di un controllo di cellule tumorali in parallelo fornisce chiarezza per il disegno dei cancelli durante l'analisi della citometria a flusso.</li>
</ol>12. Citometria a flusso
<ol><li>Accendere il citometro a flusso disponibile utilizzando una bassa velocità di flusso (500 eventi al secondo o meno) per impostare i parametri.</li>
	<li>Utilizzare il controllo delle cellule tumorali (le stesse cellule utilizzate per lo xenotrapianto) per impostare la tensione per i canali FSC (forward scatter), SSC (side scatter), BV421/CasB (vitalità), CE-594 (mCherry) e APC (CD45.2). NOTA: I campioni colorati singolarmente saranno necessari per stabilire le impostazioni di compensazione che eliminano la sovrapposizione del fluorocromo tra i distinti coloranti.</li>
	<li>Utilizzare il campione di embrione non iniettato per stabilire impostazioni che accolgano sia le cellule trapiantate che quelle di pesce zebra.</li>
	<li>Aumenta la velocità di flusso a 8000 eventi al secondo e registra 1 milione di eventi per ogni campione.</li>
	<li>Analizzare i dati risultanti utilizzando un software di analisi appropriato, selezionando prima i singoletti tracciando FSC-H v/s FSC-A (altezza v/s area), quindi un grafico per la selezione delle celle vitali. Il software FlowJo è ampiamente utilizzato per tale analisi.</li>
	<li>Utilizzando il controllo delle cellule tumorali, tracciare un cancello attorno alle cellule trapiantate mediante FSC-A v/s SSC-A, quindi utilizzare le colorazioni indicatori, in questo caso, CD45 e mCherry (Figura 5B). NOTA: Il cancello dimensionale selezionato per il tumore conterrà anche cellule di zebrafish, che forniscono la base per la normalizzazione e la determinazione del carico di malattia.</li>
	<li>Analizza i campioni di embrioni utilizzando le stesse impostazioni del cancello di cui sopra. Il grafico finale della colorazione tumorale e l'indicatore della proteina fluorescente forniranno una misura del carico di malattia (Figura 5C). NOTA: Qui, la differenza nel carico di malattia è stata tracciata per gli embrioni che ricevono un buon bolo di cellule iniettate rispetto a quelli che ricevono un bolo inferiore.</li>
	<li>Se necessario, selezionare le cellule tumorali negli embrioni mediante citometria a flusso per l'analisi molecolare a valle.</li>
</ol>

Utilizzo delle larve di pesce zebra per studi efficienti sui tumori in vivo

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+in+vivo+zebrafish+model+of+human+multiple+myeloma+to+study+preclinical+therapeutic+efficacy.">A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy.</a> Blood. 128 (2), 249-252 (2016).</li><li>Grissenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+drug+screening+in+zebrafish+xenografts+reveals+high+efficacy+of+dual+MCL-1/BCL-XL+inhibition+against+Ewing+sarcoma.">High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma.</a> Cancer Lett. 554, 216028 (2023).</li><li>Baxi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+Versatile+Animal+Model+to+Study+Tumorigenesis+Process+and+Effective+Preclinical+Drug+Screening+for+Human+Cancer+Research.">Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research.</a> Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).</li><li>Li, X., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+zebrafish+patient-derived+xenograft+tumor+models+in+the+development+of+antitumor+agents.">The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents.</a> Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenograft+model+as+a+preclinical+platform+for+uveal+melanoma+drug+discovery.">Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery.</a> Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).</li><li>Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+screening+to+identify+anti-metastatic+drugs+in+Twist1a-ER(T2)+transgenic+zebrafish.">In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish.</a> Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).</li><li>Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>Casey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+zebrafish+pediatric+brain+tumors+into+immune-competent+hosts+for+long-term+study+of+tumor+cell+behavior+and+drug+response.">Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response.</a> J Vis Exp. (123), e55712 (2017).</li><li>Soh, G. H., K&#246;gler, A. C., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+transplantation+device+for+zebrafish+embryos.">A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (174), e62767 (2021).</li><li>Martinez-Lopez, M., P&#243;voa, V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+zebrafish+larval+xenografts+and+tumor+behavior+analysis.">Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis.</a> J Vis Exp. (172), e62373 (2021).</li><li>Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+behavior+of+human+breast+cancer+cells+in+embryonic+zebrafish.">Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish.</a> J Vis Exp. (122), e55459 (2017).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Cabezas-S&#225;inz, P., Pensado-L&#243;pez, A., S&#225;inz Jr, B., S&#225;nchez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cancer+using+zebrafish+xenografts:+drawbacks+for+mimicking+the+human+microenvironment.">Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment.</a> Cells. 9 (9), 1978 (2020).</li><li>Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+analyses+using+small+fish+models+reveal+new+mechanisms+that+regulate+primary+tumorigenesis.">Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis.</a> Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+ribosomal+protein+L22+promotes+transformation+by+induction+of+the+stemness+factor,+Lin28B.">Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B.</a> Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).</li><li>Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+survival+analysis:+Kaplan-Meier+estimate.">Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate.</a> Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).</li><li>Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+zebrafish+patient-derived+xenografts+from+pancreatic+cancer+for+chemosensitivity+testing.">Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing.</a> J Vis Exp. (195), e63744 (2023).</li><li>Murali Shankar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+CAR-NK+cell-mediated+killing+efficacy+and+pharmacokinetics+in+a+rapid+zebrafish+xenograft+model+of+metastatic+breast+cancer.">Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer.</a> Front Immunol. 14, 1254821 (2023).</li><li>Takahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+lineage+cells+on+zebrafish+embryo+heart.">Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart.</a> Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).</li><li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL.">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li><li>Regan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+long-term+label-retaining+colon+cancer+stem+cells+identifies+novel+regulators+of+quiescence.">RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence.</a> iScience. 24 (6), 102618 (2021).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Lo xenotrapianto di pesce zebra è emerso come un'alternativa rapida, robusta ed economica agli studi sui topi12. Sebbene siano stati riportati diversi approcci allo xenotrapianto di pesce zebra, il nostro adattamento ha portato a miglioramenti significativi. Oltre a standardizzare i parametri relativi alla procedura, questi miglioramenti si concentrano specificamente sull'accelerazione della velocità con cui possono essere eseguite le iniezioni tumorali, consentendo così un aumento del numero d...

L'analisi del comportamento dei tumori in risposta ad alterazioni genetiche o al trattamento farmacologico in vivo è un elemento essenziale della ricerca sul cancro 1,2,3,4. Tali studi comportano il più delle volte l'uso di modelli murini immunocompromessi (Mus musculus)5; Tuttavia, gli studi sugli xenotrapianti nei topi sono limitati sotto molti aspetti, tra cui capacità limitata, durata prolungata, spese significative e la necessità di sofisticate apparecchiature di imaging per monitorare la progressione dei tumori interni 6,7. Al contrario, il modello del pesce zebra (Danio rerio) consente una maggiore capacità, una durata più breve, una spesa inferiore e, grazie alla loro trasparenza, un semplice monitoraggio della progressione della malattia 8,9.
Il pesce zebra è un sistema modello di vertebrato ben sviluppato con sviluppo ex-utero e alta fecondità, con singole femmine che producono più di 100 embrioni10. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono una facile visualizzazione dei processi di sviluppo utilizzando tecniche legate alla fluorescenza come i reporter. Infine, la conservazione dei processi critici di sviluppo li rende un modello ideale per molti tipi di studi, incluso il comportamento delle cellule maligne trapiantate11,12. Gli embrioni di zebrafish wild-type sviluppano melanociti, che li rendono otticamente opachi entro le 2 settimane di età, ma questo è stato superato dalla generazione di embrioni di casper (roya9; mitfaw2), che rimangono trasparenti per tutta la vita13. A causa delle loro proprietà ottiche, i pesci zebra casper sono riceventi ideali di cellule tumorali trapiantate 14,15,16. Lo xenotrapianto di cellule tumorali in zebrafish ha acquisito importanza negli ultimi 2 decenni 17,18,19,20,21. Gli embrioni di pesce zebra hanno un'immunità innata; Tuttavia, mancano di immunità adattativa durante il loro stadio larvale, rendendoli immunocompromessi dal punto di vista funzionale, il che consente loro di fungere da ospiti efficaci per gli xenotrapianti tumorali trapiantati22.
Sono stati sviluppati protocolli per l'attecchimento tumorale in embrioni di zebrafish e adulti che hanno considerato una serie di variabili diverse 23,24,25,26,27. Questi hanno esplorato numerosi siti di deposizione tumorale nel pesce zebra, comprese le iniezioni nel tuorlo, nello spazio peri-vitellino e nel cuore e in diversi stadi di sviluppo16,28. Anche la temperatura ambiente dell'acquacoltura per gli xenotrapianti di pesce zebra è importante poiché l'allevamento del pesce zebra avviene in genere a 28 °C, mentre le cellule dei mammiferi crescono a 37 °C. Di conseguenza, deve essere impiegata una temperatura di compromesso che sia tollerata dai pesci ma che supporti la crescita del tumore, e 34 °C sembra raggiungere entrambi gli obiettivi29. L'analisi del comportamento e della progressione dei tumori a seguito di xenotrapianto è un'altra importante area di interesse, e ciò comporta l'uso di una varietà di modalità di imaging e l'analisi della sopravvivenza30. Uno dei principali vantaggi del modello zebrafish è la disponibilità di un gran numero di animali in studio per fornire un'immensa potenza statistica agli studi in vivo del comportamento tumorale; Tuttavia, gli approcci precedenti hanno fortemente limitato questo potenziale a causa della necessità di noiose procedure di montaggio per le iniezioni.
Qui, affrontiamo questa limitazione attraverso lo sviluppo di un metodo semplice e rapido con cui mettere in scena gli embrioni che consente un'elevata produttività e il monitoraggio della qualità dell'iniezione utilizzando la linea trasparente casper zebrafish. Ciò comporta l'iniezione di xenotrapianti nel sacco vitellino degli embrioni di pesce zebra casper a 2 giorni dalla fecondazione (dpf). Osserviamo la sopravvivenza degli embrioni dopo lo xenotrapianto come parte dell'analisi del comportamento tumorale. Mostriamo inoltre la valutazione del carico di malattia dopo xenotrapianto effettuando sospensioni di singole cellule e analizzando mediante citometria a flusso (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron cell strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S43565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex bioresearch</td>
			<td>20-102GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5 Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calibration capillaries</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1424-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker CM-dil dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collageanse IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps number 55</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>model SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (Borosilicate)</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helix NP Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>425305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>model SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader (long tips for laoding cells)</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM 1000 cell microinjector</td>
			<td>MicroData Instruments, Inc. (MDI)</td>
			<td>PM1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>388763</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, rapid, and effective method for tumor xenotransplantation analysis in transparent zebrafish embryos

Gli studi in vivo sul comportamento dei tumori sono un punto fermo della ricerca sul cancro; Tuttavia, l'uso dei topi presenta sfide significative in termini di costi e tempo. Qui, presentiamo il pesce zebra larvale come un modello di trapianto che presenta numerosi vantaggi rispetto ai modelli murini, tra cui facilità di manipolazione, bassa spesa e breve durata sperimentale. Inoltre, l'assenza di un sistema immunitario adattativo durante gli stadi larvali ovvia alla necessità di generare e utilizzare ceppi immunodeficienti. Sebbene esistano protocolli consolidati per lo xenotrapianto in embrioni di zebrafish, presentiamo qui un metodo migliorato che coinvolge la stadiazione degli embrioni per un trasferimento più rapido, l'analisi della sopravvivenza e l'uso della citometria a flusso per valutare il carico della malattia. Gli embrioni vengono messi in scena per facilitare l'iniezione rapida di cellule nel tuorlo delle larve e la marcatura delle cellule per monitorare la consistenza del bolo cellulare iniettato. Dopo l'iniezione, l'analisi della sopravvivenza dell'embrione viene valutata fino a 7 giorni dopo l'iniezione (dpi). Infine, il carico di malattia viene valutato anche marcando le cellule trasferite con una proteina fluorescente e analizzando mediante citometria a flusso. La citometria a flusso è resa possibile da un metodo standardizzato di preparazione di sospensioni cellulari da embrioni di zebrafish, che potrebbe essere utilizzato anche per stabilire la coltura primaria di cellule di zebrafish. In sintesi, la procedura qui descritta consente una valutazione più rapida del comportamento delle cellule tumorali in vivo con un numero maggiore di animali per braccio di studio e in modo più economico.

Analysis of the behavior of tumors in response to genetic alteration or drug treatment in vivo is an essential element of cancer research1,2,3,4. Such studies most often involve the use of immunocompromised mouse (Mus musculus) models5; however, xenotransplantation studies in mice are limited in many respects, including limited capacity, extended duration, significant expense, and the requirement for sophisticated imaging equipment to monitor the progression of internal tumors6,7. By contrast, the zebrafish model (Danio rerio) enables greater capacity, shorter duration, lower expense, and, due to their transparency, simple monitoring of disease progression8,9.
Zebrafish is a well-developed vertebrate model system with ex-utero development and high fecundity, with individual females producing more than 100 embryos10. Moreover, zebrafish embryos are transparent, enabling easy visualization of developmental processes using fluorescence-related techniques such as reporters. Finally, the conservation of critical developmental processes makes them an ideal model for many types of studies, including the behavior of transplanted malignant cells11,12. Wild-type zebrafish embryos develop melanocytes, which render them optically opaque by 2 weeks of age, but this has been overcome by the generation of casper embryos (roya9; mitfaw2), which remain transparent throughout life13. Because of their optical properties, casper zebrafish are ideal recipients of transplanted tumor cells14,15,16. Xenotransplantation of tumor cells into zebrafish has gained importance in the past 2 decades17,18,19,20,21. Zebrafish embryos have innate immunity; however, they lack adaptive immunity during their larval stage, rendering them functionally immunocompromised, which enables them to serve as effective hosts for transplanted tumor xenografts22.
Protocols have been developed for tumor engraftment in zebrafish embryos as well as adults that have considered a number of different variables23,24,25,26,27. These have explored numerous sites of tumor deposition in zebrafish, including injections in yolk, peri-vitelline space, and heart and at different developmental stages16,28. The ambient temperature of aquaculture for zebrafish xenografts is also important as zebrafish rearing typically occurs at 28 &#176;C, while mammalian cells grow at 37 &#176;C. Consequently, a compromise temperature must be employed that is tolerated by the fish yet supports tumor growth, and 34 &#176;C appears to achieve both goals29. Analysis of the behavior and progression of tumors following xenotransplantation is another major area of focus, and this involves the use of a variety of imaging modalities as well as survival analysis30. One of the major advantages of the zebrafish model is the availability of large numbers of study animals to provide immense statistical power to in vivo studies of tumor behavior; however, previous approaches have severely limited this potential because of the requirement of tedious mounting procedures for injections.
Here, we address this limitation through the development of a simple, rapid method with which to stage embryos that enables high throughput and monitoring of injection quality using the transparent casper zebrafish line. This entails the injection of xenografts into the yolk sac of the casper zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf). We observe the survival of embryos following xenotransplantation as part of tumor behavior analysis. We further show the assessment of disease burden after xenotransplantation by making single cell suspensions and analyzing by flow cytometry (Figure 1).

Autore in primo piano: Avanzamento delle terapie antitumorali utilizzando lo xenotrapianto tumorale nel pesce zebra

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

We seek to gain molecular insight into the control of normal and malignant hematopoiesis and then to exploit those insights to develop new therapies for the treatment of blood cancers. Tumor xenografts are an indispensable tool for evaluating the impact of a genetic alteration or treatment on tumor behavior. However, mice xenografts are expensive, time consuming, and limited in scope.Using zebrafish for tumor xenotransplantation overcomes all these drawbacks. In this protocol, we demonstrate an easy and rapid mounting process for xenotransplantation, which increases throughput. We further employ cell staining to know the quality of the inoculum and then flow cytometry to assess the tumor progression by evaluating or quantifying the disease burden.We intend to use this approach to identify novel ways of blocking the function of the Ras/MAP kinase cascade, which drives the vast majority of human cancers. And we'll do that not by trying to block the catalytic activity of the Ras/MAP kinase cascade but rather by preventing its ability to phosphorylate those cancer-driving substrates it modifies.

Xenotrapianto Una visione completa dell'intero esperimento e dell'analisi è illustrata nella Figura 1, che va dalla produzione di embrioni alla valutazione della progressione della malattia mediante analisi della sopravvivenza e del carico di malattia mediante citometria a flusso. Questo approccio apporta diversi miglioramenti che migliorano la riproducibilità e la scalabilità dello xenotrapianto, oltre ad aggiungere un nuovo modo di valutare il carico di malattia. Il ...

Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Cerchiamo di ottenere informazioni molecolari sul controllo dell'emopoiesi normale e maligna e quindi di sfruttare tali informazioni per sviluppare nuove terapie per il trattamento dei tumori del sangue. Gli xenotrapianti tumorali sono uno strumento indispensabile per valutare l'impatto di un'alterazione genetica o di un trattamento sul comportamento del tumore. Tuttavia, gli xenotrapianti di topi sono costosi, richiedono tempo e hanno una portata limitata.L'uso del pesce zebra per lo xenotrapianto tumorale supera tutti questi inconvenienti. In questo protocollo, dimostriamo un processo di montaggio facile e rapido per lo xenotrapianto, che aumenta la produttività. Utilizziamo inoltre la colorazione cellulare per conoscere la qualità dell'inoculo e quindi la citometria a flusso per valutare la progressione del tumore valutando o quantificando il carico di malattia.Intendiamo utilizzare questo approccio per identificare nuovi modi per bloccare la funzione della cascata chinasica Ras/MAP, che guida la stragrande maggioranza dei tumori umani. E lo faremo non cercando di bloccare l'attività catalitica della cascata della chinasi Ras/MAP, ma piuttosto impedendo la sua capacità di fosforilare quei substrati cancerogeni che modifica.

a-simple-rapid-effective-method-for-tumor-xenotransplantation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

597 Views.  Fox Chase Cancer Center. Cerchiamo di ottenere informazioni molecolari sul controllo dell'emopoiesi normale e maligna e quindi di sfruttare tali informazioni per sviluppare nuove terapie per il trattamento dei tumori del sangue. Gli xenotrapianti tumorali sono uno strumento indispensabile per valutare l'impatto di un'alterazione genetica o di un trattamento sul comportamento del tumore. Tuttavia, gli xenotrapianti di topi sono costosi, richiedono tempo e hanno una portata limitata.L'uso del pesce zebra per lo ...

Video: Autore in primo piano: Avanzamento delle terapie antitumorali utilizzando lo xenotrapianto tumorale nel pesce zebra

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.