Fissaggio e blocco di colture di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) 2D per analisi immunoistochimiche

Per iniziare, aggiungi 30 millilitri di idrossido di potassio al 5% in metanolo a un tubo da 50 millilitri. Incubare 100 vetrini coprioggetti con un diametro di 12 millimetri nella provetta per 30 minuti sotto costante agitazione. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetto in acqua demineralizzata per 30 minuti.

Una volta completato il lavaggio, trasferire i vetrini di copertura in una soluzione isopropilica al 70% per la conservazione. Per rivestire i vetrini, appoggiarli prima singolarmente contro la parete di una piastra di Petri quadrata. Quando l'alcol isopropilico è evaporato, trasferirli in una piastra a 24 pozzetti.

Pipettare un millilitro di collagene in PBS in ogni pozzetto e incubare. Successivamente, lavare i vetrini coprioggetto circa 4 o 5 volte per cinque minuti ciascuno con un millilitro di PBS. Pipettare gli HUVEC coltivati nei pozzetti con i vetrini di copertura rivestiti.

Dopo aver coltivato le cellule per il periodo di tempo desiderato, lavare le cellule in un millilitro di PBS per cinque minuti. Fissare le cellule in un millilitro di paraformaldeide al 2% per 20 minuti a temperatura ambiente. Ora, sciacquare le celle in un millilitro di PBS per 3 o 4 cicli di lavaggio di cinque minuti ciascuno.

Infine, pipettare un millilitro di tampone bloccante nella piastra a pozzetti prima della colorazione.