Per iniziare, aggiungi gli HUVEC in una provetta Falcon da 10 millilitri contenente otto millilitri di terreno di crescita endoteliale. Aggiungere due millilitri di soluzione madre METHOCEL nella provetta e agitare bene. Quindi, trasferire 25 microlitri di miscela sulla superficie interna capovolta di una grande capsula di Petri quadrata.
Ruotare delicatamente il coperchio di 180 gradi e posizionarlo sul fondo di un recipiente per colture cellulari e incubare per una notte. Il giorno successivo, aggiungere 2,3 millilitri di collagene di coda di ratto di tipo I a una fiala contenente 0,28 millilitri di 10X Medium 199. Tenete il composto sul ghiaccio e mescolate fino a quando non sarà uniformemente giallo.
Titola la miscela con l'idrossido di sodio fino a quando non diventa arancione. Quindi, aggiungere 50 microlitri di tampone HEPES al prodotto finale. Raccogliere le cellule coltivate sospese in una provetta Falcon da 50 millilitri con 20 millilitri di PBS, quindi centrifugare.
Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 0,1 millilitri di FBS e 0,4 millilitri di terreno basale endoteliale al pellet sferoide. Picchiettare delicatamente il tubo per risospendere il pellet. Ora, pipettare due millilitri di soluzione madre METHOCEL e mescolare bene.
Quindi, aggiungere due millilitri della miscela di collagene preparata agli sferoidi risospesi. Erogare 0,5 millilitri della miscela risultante nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e incubare. Quindi, pipettare 100 microlitri di fattore di crescita endoteliale vascolare umano ricombinante diluito nei pozzetti della piastra.
Incubare la coltura cellulare a 37 gradi Celsius con un'integrazione di anidride carbonica al 5% per 12 ore. Il giorno successivo, con un microscopio invertito, catturare le immagini degli sferoidi che non sono a contatto con il bordo del pozzo, tra loro, o mostrano segni di danneggiamento. Gli sferoidi stimolati con solo il mezzo basale o con il fattore di crescita endoteliale vascolare umano ricombinante erano chiaramente distinguibili.
Gli sferoidi in gel di bassa qualità sembravano cadere a terra e disperdersi. Il controllo negativo ha mostrato un moderato tasso di germinazione al basale, mentre il fattore di crescita dell'endotelio vascolare umano ha raddoppiato o triplicato la lunghezza relativa di germinazione. Il numero di germogli ha mostrato una gamma dinamica simile.
