Per iniziare, prendi cellule di cancro epiteliale ovarico di topo in coltura. Rimuovere il terreno di coltura dalle piastre di Petri e lavare due volte con DPBS. Aggiungere 20 millilitri di Dulbecco's Modified Eagle Medium senza FBS e soluzione di penicillina-streptomicina.
Incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 48 ore. Quindi raccogliere il surnatante della coltura cellulare da 20 piastre di Petri di 15 centimetri di diametro. Centrifugare a 300 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante.
Centrifugare il surnatante a 2.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante per rimuovere i detriti cellulari. Ora accendi la pompa del vuoto e collegala alla presa d'aria del sistema di filtrazione del vuoto. Filtrare il surnatante attraverso la membrana in polietersulfone da 0,22 micron per rimuovere vescicole o impurità di dimensioni superiori a 0,22 micron.
Aggiungere 15 millilitri di surnatante filtrato alla camera d'aria della provetta di ultrafiltrazione da 100 kilodalton. Centrifugare a 3, 500 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il liquido dal tubo esterno.
Quindi, raccogli il liquido dalla camera d'aria. Aggiungere un millilitro di DPBS alla camera d'aria. Pipettare ripetutamente per risospendere gli esosomi e quindi raccoglierli.
Centrifugare il liquido a 10.000 g per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga a scatto rapido da sei millilitri e sigillarla con una termosigillatrice. Aprire la provetta dopo l'ultracentrifugazione del surnatante per due ore.
Una volta rimosso il surnatante, risospendere il pellet in 100 microlitri di DPBS per ottenere la soluzione esosoma.
