Per iniziare, in una cappa di coltura cellulare, aggiungere il lipoaspirato raccolto in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Trasferire il lipoaspirato in una siringa Luer lock sterile da 20 millilitri. Quindi collegare un connettore da 1,4 millimetri alla siringa.
Collegare ora una seconda siringa Luer lock da 20 millilitri al lato controlaterale del connettore. Spingere il tessuto adiposo da una siringa all'altra circa 30 volte. Quindi trasferire il grasso emulsionato in una provetta da centrifuga fresca da 50 millilitri.
Centrifugare il grasso a 500 g per 10 minuti. Quindi scartare lo strato superiore oleoso. Raccogliere lo strato centrale purificato contenente lo strato vascolare stromale separato e trasferirlo in una provetta da centrifuga fresca da 50 millilitri.
Ora riempi la provetta da centrifuga con DMEM integrato fino a 40 millilitri. Centrifugare nuovamente la provetta a 500 G per cinque minuti. Raccogliere lo strato di mSVF risultante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri.
In una provetta sterile da 1,5 millilitri, pipettare 100 microlitri della frazione vascolare stromale isolata. A questo, aggiungere 10 microlitri di trombina, quindi pipettare 10 microlitri di cloruro di calcio. Infine, aggiungere 70 microlitri di acido tranexamico alla miscela.
Con un puntale della pipetta nuovo, aggiungere 10 microlitri di fibrinogeno al tubo poco prima dell'applicazione. Dopo la polimerizzazione della miscela di idrogel mSVF, pipettare 200 microlitri di idrogel in una piastra a 12 pozzetti per scopi analitici. Ora aggiungi 100 microlitri di idrogel di fibrina in un pozzetto come controllo negativo.
Incubare la piastra a 12 pozzetti a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto. Riposizionare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore per quattro ore.
Aggiungere un millilitro di resazurina a ciascun pozzetto prima di incubare nuovamente per 24 ore. Pipettare i campioni di resazurina in una piastra a 96 pozzetti. Il giorno successivo, utilizzare un lettore di micropiastre multimodale per imaging cellulare per misurare la prima intensità di fluorescenza.
Per l'analisi istologica nei giorni uno, tre e sette, incubare l'idrogel di fibrina in 0,5 millilitri di paraformaldeide al 4%. Ora aggiungi l'1% di PBS al piatto e conservalo a quattro gradi Celsius. Il test della resazurina è stato eseguito per quantificare la vitalità cellulare in vitro della frazione vascolare e dell'idrogel.
La frazione vascolare ha mostrato una ridotta vitalità il terzo giorno, mentre la combinazione di idrogel mSVF-fibrina è rimasta vicina al basale. Entro il settimo giorno, la vitalità della mSVF è diminuita, mentre la combinazione di idrogel di mSVF e fibrina è aumentata. L'analisi istologica non ha mostrato alcuna riduzione del numero di nuclei cellulari nei giorni tre e sette.
L'idrogel di fibrina ha mostrato una degradazione minima con cluster cellulari visibili distribuiti uniformemente.
