Per iniziare, prepara le miscele di siero ed enzimi insieme ai rispettivi controlli. Nel lettore di micropiastre, è possibile impostare un protocollo di lettura cinetica per misurare l'assorbanza a 260 nanometri con l'intervallo di lettura più breve per 30 minuti. Successivamente, scongelare tutti i campioni congelati su ghiaccio e diluire ogni campione scongelato da 1 a 10 con 1x PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius in provette per microcentrifuga LoBind.
Per preparare un brodo di adenosina da cinque millimolari, aggiungere 66,8 milligrammi di adenosina a 50 millilitri di 1x PBS. Dopo averla diluita in una soluzione da 250 micromolari, preriscaldare l'adenosina a 37 gradi Celsius in un'incubatrice. A una micropiastra compatibile con i raggi ultravioletti a 96 pozzetti, aggiungere 160 microlitri di adenosina seguiti da 40 microlitri di ciascun campione di proteina diluita in triplicati.
Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 260 nanometri per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per l'analisi dei dati, esportare i dati in un foglio di calcolo, quindi determinare la pendenza della regione lineare dei dati di assorbanza in funzione del tempo per i primi minuti. Sottrarre la pendenza del controllo negativo costituito da siero umano aggregato o PBS dalle pendenze rispettivamente delle miscele di enzimi più siero e delle miscele di enzimi più PBS.
Infine, normalizzare tutte le pendenze regolate alla pendenza originale al punto dell'ora zero per ottenere la frazione di attività rimanente utilizzando l'equazione e tracciare la frazione di attività rimanente rispetto al tempo. L'attività di HsADA1 wildtype è diminuita più rapidamente nel siero umano aggregato rispetto a 1x PBS in cinque giorni. Le curve di declino dell'assorbanza per HsADA1 wildtype hanno mostrato una pendenza iniziale più ripida al giorno zero rispetto al quinto giorno.
I campioni di controllo negativi hanno mostrato una variazione trascurabile dell'assorbanza rispetto ai campioni enzimatici.
