Per preparare cilindri lunghi un centimetro di diametro un centimetro, scaldate un tagliacartone sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen, e tagliate un tubo da 15 millilitri con la lama riscaldata. Coprire un lato dei cilindri con pezzi di Parafilm. Dopo aver anestetizzato l'axolotl e essersi assicurati che non risponda agli stimoli tattili, orientare l'arto perpendicolarmente all'asse del corpo.
Amputare l'arto immediatamente distalmente all'area calcificata della regione zeugopodiale. Rimettere l'axolotl in un serbatoio contenente acqua di ritenzione fresca con analgesici. Dopo 24 ore, trasferire nuovamente l'axolotl in acqua fresca di contenimento e lasciare che l'arto si rigeneri fino allo stadio di interesse desiderato.
Dopo aver posizionato l'axolotl anestetizzato sotto uno stereomicroscopio, misurare la lunghezza dell'arto allo stadio di rigenerazione desiderato per l'istolisi e gli stadi di condensazione della cartilagine. Dopo aver raccolto gli arti, metterli in una capsula di Petri per la dissezione. Sotto uno stereomicroscopio, sezionare gli arti con un bisturi all'altezza del gomito e metterli in una capsula di Petri contenente una soluzione di APBS.
Disporre le pipette Pasteur e il blocco termico impostato a 37 gradi Celsius con aliquote di agarosio sulla piattaforma di lavoro. Rimuovere il blocco freddo dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e posizionare sopra il cilindro con l'estremità ricoperta di Parafilm rivolta verso il basso. Posizionare l'arto su una piastra pulita e rimuovere delicatamente il liquido in eccesso dall'arto sezionato con carta velina.
Aggiungere l'agarosio fuso a basso punto di fusione sulla parte superiore e muovere brevemente l'arto nell'agarosio per spostare l'APBS rimanente dalla superficie della pelle. Posizionare rapidamente l'arto all'interno del cilindro, assicurandosi che sia orientato verticalmente con l'area di interesse rivolta verso l'alto. Aggiungere l'agarosio a basso punto di fusione all'interno del cilindro fino a coprire completamente il tessuto.
Quindi, rimuovere il cilindro dal blocco freddo e lasciare solidificare l'agarosio per 30 secondi. Dopo la solidificazione, rimuovere il Parafilm dal fondo del cilindro e fissare il tessuto contenente agarosio al tavolino del vibratomo con colla cianoacrilica. Quindi, rimuovere l'eccesso di agarosio circostante con un bisturi.
Immergere il palco nella soluzione APBS per il sezionamento. Iniziare a sezionare l'agarosio con incrementi di 100 micrometri fino a raggiungere la punta del tessuto. Quindi, sezionare fino a rimuovere la parte distale del tessuto.
Usando una lama di rasoio, rimuovere con cura il blocco di agarosio contenente tessuto dal tavolino del vibratomo. Fissare immediatamente il blocco a una piastra di Petri di plastica da 35 millimetri con colla adesiva per tessuti chirurgici. Aggiungere circa due millilitri di terreno di coltura per coprire il tessuto.
