Prima della microscopia a forza atomica o delle misurazioni AFM, montare il cantilever su un blocco di vetro. Inserire una piastra di Petri riempita di PBS nel supporto dello stadio motore e inserire il blocco di vetro nella testa AFM. Quindi posizionare la testa AFM sopra la piastra di Petri in modo che il cantilever sia immerso nel buffer e allineare manualmente il laser.
Nel software JPK, premere il pulsante di avvicinamento e acquisizione per far avanzare il cantilever su una superficie dura. Una volta acquisita la singola curva forza-distanza, aprire il gestore di calibrazione e in metodo, selezionare Basato sul contatto. Quindi regolare la temperatura ambiente a 20 gradi Celsius.
Ora ingrandisci la curva e seleziona la parte lineare per l'adattamento della sensibilità. Fare clic sulla casella di controllo della sensibilità e ritrarre il cantilever di 200 micrometri dalla superficie. Quindi selezionare la casella di controllo del simbolo dell'infinito e fare clic su Esegui rumore termico.
Quindi, ingrandisci il grafico della frequenza risultante e definisci un intervallo utilizzando il pulsante destro del mouse. Selezionare la casella di controllo Costante molla e chiudere il gestore di calibrazione. Inserire la piastra di Petri contenente l'arto axolotl rigenerato incorporato nel blocco tissutale e nel terreno di coltura nel supporto per piastre dell'AFM.
Acquisisci un'immagine panoramica del blocco di tessuto in modalità campo chiaro. Ingrandisci la regione di interesse e regola il tempo di esposizione e la messa a fuoco. Imposta i parametri della griglia per le misurazioni dell'indentazione e registra una serie di curve forza-distanza.
Per l'elaborazione dei dati nel software PyJibe, aprire il file contenente la curva di spostamento della forza. Selezionare la scheda di pre-elaborazione e, sotto la stima del punto di contatto, selezionare l'adattamento a tratti con linea e polinomio. Quindi selezionare la scheda Adatta (Fit) e in Modello (Model), selezionare Penetratore sferico, In Metodo (Method), selezionare nelder.
Per l'analisi viscoelastica nel software PyJibe, aprire il file contenente la curva di distanza della forza. Selezionare la scheda di pre-elaborazione e, sotto la stima del punto di contatto, selezionare l'adattamento a tratti con linea e polinomio. Quindi selezionare la scheda di adattamento e in modello, selezionare il modello Hertz corretto per la viscoelasticità utilizzando il modello KVM.
In metodo, selezionare leastsq. Impostare il raggio preciso del penetratore a 10 micrometri e la velocità di avvicinamento a 7,5 micrometri al secondo. Premere Applica modello e adatta tutto per ottenere i moduli di Young apparenti e non rilassati, la viscosità apparente e il tempo di rilassamento dell'elemento Maxwell.
Le misurazioni del modulo di Young apparente del radio e dell'ulna negli arti intatti non hanno mostrato differenze significative. Durante la fase di islisi, i moduli apparenti di Young del radio e dell'ulna diminuirono drasticamente rispettivamente a 0,03 e 0,13 kilopascal. I moduli apparenti di Young al centro della cartilagine intatta erano più alti che nella periferia.
Nella fase di istolisi, le misurazioni apparenti del modulo di Young non hanno mostrato differenze significative tra il centro della cartilagine e la periferia. Durante la condensazione della cartilagine, i moduli apparenti di Young sono aumentati significativamente a 0,77 kilopascal che rappresentano valori di rigidità intermedi. I moduli non rilassati hanno mostrato differenze sostanziali nel tessuto intatto durante l'istolisi e nella cartilagine condensata.
I moduli di Young apparenti erano molto simili ai moduli non rilassati, indicando una risposta prevalentemente elastica. La viscosità apparente era significativamente più bassa durante l'istolisi rispetto al tessuto intatto e alla cartilagine condensata.
