Per iniziare, aggiungere 500 microlitri di tampone immagine privo di proteine al canale 3 della cella di flusso. Mescolare due nanomolari di Saccharomyces cerevisiae NAP1 e da due a cinque nanomolari di ottamero istonico H4 marcato con LD655 con 500 microlitri di tampone 1X HR. Aggiungere questa miscela al canale 4 della cella di flusso.
Far scorrere tutti i canali a 1,0 bar per 30 secondi per lavarli con i campioni. Impostare il flusso a 0,2 bar e spostare le trappole ottiche sul canale 1 per catturare un paio di perle rivestite di streptavidina adatte. Quindi, sposta le trappole ottiche sul canale 3.
Spegnere il flusso ed eseguire una calibrazione forzata per la coppia di perline. Accendere il laser confocale rosso e calibrare l'area di imaging. Dopo aver impostato il flusso a 0,2 bar, spostare le trappole ottiche sul canale 2 per catturare il DNA biotinilato.
Quindi spostare le trappole ottiche sul canale 3 e interrompere il flusso. Aumentare la distanza tra le trappole ottiche per allungare il DNA e monitorare la curva di distanza forzata associata per confermare la presenza di un singolo cavo di DNA. Regolare la distanza tra le trappole ottiche in modo che la tensione del DNA sia di circa un piconewton.
Attiva la scansione della linea per iniziare a raccogliere un chimografo con il laser rosso acceso. Quindi sposta le trappole ottiche sul canale 4 con il flusso per formare nucleosomi lungo il cavo del DNA. Per scartare i nucleosomi, spostare le trappole ottiche sul canale 3.
Impostando la lettura della forza su 0 e la velocità su 0,1 micrometri al secondo, allontanare la trappola ottica 1 dalla trappola ottica 2. Mescolare 10 nanomolari di istone H1.4 marcato con Cy3 con 500 microlitri di tampone di immagine e aggiungere al canale 5. Dopo aver formato un cavo di DNA contenente nucleosomi, accendi il laser verde, oltre al laser rosso, e sposta le trappole ottiche sul canale 5 per l'imaging in tempo reale del legame H1 alla cromatina.
La formazione di nucleosomi lungo il cavo del DNA è stata visualizzata come focolai fluorescenti rossi stazionari su una scansione 2D e un chimografo. L'analisi del fotosbiancamento ha mostrato eventi di fotosbiancamento in una o due fasi, indicando la presenza di mononucleosomi. In assenza di NAP1, gli ottameri istonici legavano il DNA, ma rimanevano per lo più srotolati, indicato dalla tensione costante.
Utilizzando l'H2A marcato con Cy3, sono stati ottenuti risultati di assemblaggio del nucleosoma simili, come con l'H4 marcato con LD655. Lo srotolamento dei nucleosomi ha aumentato la distanza del cavo nel tempo, visibile sul chimografo, e ha generato curve di distanza forzate con strappi caratteristici che denotano lo srotolamento dei singoli nucleosomi. Il legame dell'istone H1 linker alla cromatina è stato indicato da focolai fluorescenti verdi con traiettorie stazionarie a doppio colore che rappresentano il legame di H1 ai nucleosomi e traiettorie frastagliate verdi che rappresentano traiettorie H1 diffuse.
