Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Le tecniche a singola molecola sono strumenti potenti per studiare la meccanica, la coordinazione e la composizione dei sistemi cromatinici. E quindi, i ricercatori sono sempre alla ricerca di metodi migliori per generare substrati nucleosomici. Qui descriviamo un protocollo per formare nucleosomi attraverso il DNA in C2 in una singola molecola di forza correlativa e microscopio a fluorescenza.

Tipicamente, i substrati dei nucleosomi sono realizzati assemblando nucleosomi su DNA contenente forti sequenze di posizionamento tramite dialisi salina. Sebbene ciò abbia dei vantaggi, genera nucleosomi artificialmente stabili ed è pesante con i reagenti. Il nostro protocollo prepara substrati nucleosomici per la microscopia a fluorescenza a forza correlata a singola molecola senza sequenze di DNA specifiche e con molti meno reagenti, il tutto in pochi minuti.

Questo protocollo consente l'assemblaggio dei nucleosomi su sequenze di DNA nativo, una facile regolazione della densità dei nucleosomi, nonché una riduzione dei tempi di preparazione e dell'uso di reagenti. Inoltre, la formazione di cavi di DNA nucleosomico in C2 consente un flusso di lavoro sperimentale più semplice e la comodità della visualizzazione e della manipolazione di singole molecole integrate. Quando il posizionamento uniforme e specifico dei nucleosomi non è una parte essenziale dell'esperimento, i nostri risultati possono aiutare gli scienziati a studiare la cromatina e le sue proteine minerarie a livello di singola molecola in modo più efficiente.

Con il tempo e le risorse risparmiate, è possibile eseguire ulteriori esperimenti per indagare ulteriormente su ulteriori variabili e condizioni. Le aree di ricerca applicabili a cui stiamo attualmente pensando includono la meccanica della cromatina regolata da varianti istoniche e altre modifiche post-traduzionali. Stiamo anche pensando agli impegni biofisici e alla cinetica di altre proteine leganti la cromatina.

E infine, stiamo anche pensando ai processi di assemblaggio di ordine superiore guidati dai nucleosomi, come la condensazione biomolecolare.