Per iniziare, rivestire le piastre a 24 pozzetti con la soluzione di rivestimento e incubare per due ore a 37 gradi Celsius o per una notte a temperatura ambiente. Lavare le piastre due volte con acqua sterile e conservarle a temperatura ambiente fino a quando le celle non sono pronte per la placcatura. Ora prendi una sezione del digiuno di cavallo e mettila in una soluzione fredda di suoneria sul ghiaccio.
Togliere una porzione di 10 centimetri dal digiuno e aprirla in corrispondenza del bordo anti-mesenterico, posizionando al centro le regioni non linfoidi. Quindi tagliare la porzione in una sezione di circa sette per sette centimetri e sciacquare bene il tessuto in una soluzione di suoneria fresca prima della dissezione. Ora fissa il tessuto su una piastra di Petri rivestita in elastomero siliconico in soluzione di anello freddo, o PBS, con il lato della mucosa rivolto verso l'alto, allungandolo il più possibile.
Usando una pinza curva, rimuovere i villi intestinali, quindi rimuovere lo strato di lamina propria dalla regione non linfoide di circa cinque per cinque centimetri. Successivamente, con le forbici per microdissezione, rimuovere la sottomucosa in un foglio liberandola in un angolo. Osservare la separazione naturale mentre si stacca la sottomucosa dallo strato muscolare circolare interno.
Quindi tritare lo strato sottomucoso raccolto in pezzi da due a cinque millimetri. Mettili in un tubo conico da 50 millilitri, contenente cinque millilitri di orgono senza FBS, collagenasi, proteasi e BSA. Incubare il tessuto per due o tre ore a 37 gradi Celsius per la digestione enzimatica.
Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di orgono a temperatura ambiente con FBS per fermare l'azione dell'enzima. Pipettare la miscela di tessuto su e giù 15 volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri per dissociare le cellule dal tessuto. Quindi centrifugare il composto a 3000 G per tre minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di PBS a temperatura ambiente pipettando la soluzione su e giù 15 volte con una pipetta sierologica da 10 millilitri. Centrifugare la provetta conica a 3000 G per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver eliminato il surnatante, risospendere il pellet in 10 millilitri di temperatura ambiente con FBS pipettando su e giù 15 volte.
Quindi, filtrare le cellule in sequenza attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri, 70 micrometri e 40 micrometri. Dopo aver centrifugato le celle e scartato il surnatante, risospendere il pellet in un millilitro di orgono con FBS. Quindi colorare le cellule con il tripano blu per identificare le cellule vive e contarle utilizzando un emocitometro.
Ora semina circa 400.000 cellule in 300 microlitri di orgono con FBS in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere cinque microlitri di N2, cinque microlitri di G5 e 10 microlitri di B27 a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per consentire l'adesione cellulare.
Quando le cellule dal primo passaggio raggiungono il 70-80% di confluenza, esporre i pozzetti a zero, 10 e 25 nanogrammi di interleuchina-1 beta per 24 ore. Nelle colture sono state osservate cellule a forma di fuso coerenti con la morfologia gliale enterica, con pleomorfismo e contaminazione minima da altri tipi di cellule.
