Per iniziare, rivestire gli inserti Transwell con 42 microlitri di 0,05% Matrigel. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius per consentire a Matrigel di solidificarsi. Aspirare il terreno extra e asciugare i Transwells per 30 minuti senza coperchio.
Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno DMEM F12 a ciascun inserto e conservare a 37 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Lavare le polpette Matrigel contenenti gli organoidi con PBS. Esponili a 500 microlitri di recupero cellulare mentre sono in ghiaccio e pipetta ripetutamente la miscela per garantire una raccolta completa di cellule in una provetta da 15 millilitri.
Quindi centrifugare la provetta a 300 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel volume target della cellula staminale epiteliale intestinale o del terreno IESC. Ora, pre-rivestire una siringa da un millilitro in terreno IESC, aspirare la sospensione cellulare attraverso un ago calibro 16.
Quindi sostituire l'ago calibro 16 con un ago calibro 28 ed espellere la sospensione per favorire la separazione degli organoidi. Quindi, posizionare 200 microlitri della sospensione cellulare risultante nel lato apicale dei Transwell rivestiti. Aggiungere 500 microlitri di terreno IESC e fattori di crescita sul lato basale.
Utilizzare una camera di misura TEER a doppio elettrodo per quantificare il TEER attraverso i monostrati. Riempire il contenitore di coltura con 1,5 millilitri di terreno IESC e assicurarsi che siano presenti esattamente 200 microlitri di terreno nell'inserto Transwell, in modo che i livelli del fluido corrispondano durante la misurazione. Esporre l'aspetto basolaterale degli inserti Transwell alle citochine infiammatorie dell'interleuchina-1 beta o ai prodotti gliali provenienti da colture esposte all'interleuchina-1 beta.
Misurare il TEER ogni 10-15 minuti per 45 minuti inserendo ciascun Transwell nella tazza di coltura. L'esposizione basolaterale a terreni provenienti da colture gliali trattate con 10 e 25 nanogrammi di interleuchina-1 beta ha aumentato significativamente la permeabilità della barriera epiteliale. Non è stato osservato alcun aumento significativo della permeabilità epiteliale dopo l'esposizione all'interleuchina-6 equina a varie concentrazioni.
