1. Assemblea del Cell System flusso con tutti i componenti Il sistema a flusso assemblato comprende: tubi autoclavabile, trappole bolla, medio / scarto e celle di flusso, come mostrato nella Figura 1. Tutte queste parti possono essere riutilizzate tra esperimenti. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La cella di configurazione del flusso di sistema (componenti essenziali del setup). Il sistema di cella di flusso è composto da diversi componenti: una bottiglia di media, una pompa peristaltica, trappole bolla, la cella di flusso, una bottiglia di rifiuti, e diverse sezioni di tubi collegati tra loro da vari connettori. Figura gentilmente fornito da Rune Lyngklip. 2. Assemblea della cella di flusso <ol><li> La cella di flusso (Figura 2a) è trattata con corsie sottile di colla di silicone, con una siringa (Figura 3). </li><li> Inserire una copertura antiscivolo sulla parte superiore delle linee di silicone (Figura 3). Scivola copertura in vetro vengono utilizzati come substrato per P. aeruginosa, mentre scivola copertura in PVC vengono applicate per S. Saccharomyces biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema di cella a flusso e gorgogliatore 2. Descrizione dettagliata delle dimensioni utilizzate per la produzione di: a) flusso bolla trappola cellulare b), DTU Systems Biology. Ristampato con il permesso di John Wiley &amp; Sons, Inc. (DTU Systems Biology era precedentemente intitolato Biocentrum, come illustrato in figura) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Illustrazione delle linee di silicone applicazione della colla per il montaggio del substrato di vetro. Il vetro di copertura indicata è posizionato sopra la colla siliconica per fissarlo alla cella di flusso. <ol start="3"><li> Girare la cella di flusso e posizionarlo su una superficie piana con il lato antiscivolo coperchio verso il basso. Premere delicatamente sulla parte posteriore della cella di flusso per spingere la polizza di copertura sulla base della cella di flusso. Girare la cella di flusso più e per ispezionare le zone che non sono sigillate dal silicone. L&#39;(pistone) gestire parte di una siringa può essere utilizzato come uno strumento per premere delicatamente la cella di vetro e il flusso insieme. </li></ol> 3. Bottiglia di media <ol><li> Posizionare un tubo in silicone alimentare (2 mm di diametro interno) in una bottiglia di medie e inserire un connettore dritto all&#39;altra estremità. </li><li> Aggiungi medio della bottiglia (per il contenuto medio vedi paragrafo &quot;media&quot;) Coperchio del connettore e bottiglia con un foglio di metallo e autoclave del mezzo. Assicurarsi che l&#39;estremità del tubo di alimentazione è fisso al di sopra del livello del liquido nella bottiglia medio o un effetto sifone può svuotare la bottiglia di media quando autoclave. </li></ol> 4. Collegamento del gorgogliatore, cella di flusso e Pompa Montare tutti i tubi secondo lo schema in Figura 1. Utilizza tubi al silicone, tranne per la parte che passa attraverso la pompa peristaltica in cui viene applicato tubi Marprene. <ol><li> Al fine di collegare il tubo dalla bottiglia medio-tutte le camere flusso individuali, dividere un tubo nel numero di ingressi applicati durante l&#39;esperimento. Utilizzare connettori a T per rendere il numero auspicabile di tubi di collegamento dal tubo di alimentazione per i tubi Marprene nella pompa (vedi Figura 1, connettore a T). E &#39;generalmente una buona idea per mantenere lo stesso ordine sequenza di tubi e celle di flusso in tutto il sistema, per facilitare l&#39;identificazione dei componenti in caso di guasti nel sistema. </li><li> Collegare ogni singolo tubo di alimentazione (2 mm di diametro) a Marprene tubi nella pompa utilizzando connettori diritti. Collegare il tubo Marprene ad un gorgogliatore (Figura 2b) tramite un tubo in silicone intermedio (1 mm di diametro). Assicurarsi che la pompa è collegata all&#39;ingresso nella parte più alta del gorgogliatore. </li><li> Collegare il tubo di uscita risultante delle trappole bolla per l&#39;ingresso cella di flusso (1 mm di diametro), assicurarsi che la lunghezza di questi tubi permette la cella di flusso per essere trasferito alla fase del microscopio confocale (in genere 1 m). </li><li> Mettere 5 ml siringhe in cima alla trappole bolla. Chiudere la parte superiore con tappi idonei. </li><li> Sulla presa di cella di flusso collegare un breve, circa 40 pezzi mm (1 mm di diametro), tubi e utilizzare una &quot;riduzione&quot; connettore dritto per collegare un tubo di scarico (2 mm di diametro) della lunghezza necessaria. Posizionare i tubi dei rifiuti nel contenitore dei rifiuti. </li><li> È importante sottolineare che il contenitore dei rifiuti deve essere sempre posizionato allo stesso livello come le cellule di flusso, mai al di sotto del flusso delle cellule livello. Inoltre, assicurarsi che la fine del tubo di scarico è fissato al di sopra del livello previsto di rifiuti liquidi per evitare la filo-back a causa di un effetto sifone quando si maneggiano le celle di flusso. </li></ol> 5. STERILIZZAZIONE E LAVAGGIO DEL SISTEMA DI FLUSSO <ol><li> Togliere i tappi gorgogliatore e metterli in etanolo al 70% per tenerli sterili. </li><li> Marcia a velocità massima della pompa per riempire il sistema con il 0,5% (v / v) di ipoclorito di sodio in acqua. &lt;/ Li&gt; <li> Posizionare i tappi bolla trappola indietro quando la bolla trappole sono completamente riempiti. </li><li> Toccare il flusso di cellule per rimuovere le bolle nella camera di flusso. Fare attenzione a non danneggiare il vetro fragile coperchio. </li><li> Consentono al sistema di sterilizzare per 3-4 ore ad un flusso di 3 ml / h / canale (portata 0,2 mm / s lineare). </li><li> Lavare il sistema 2-3 volte a lavare tutte le ipoclorito. Riempire e svuotare l&#39;impianto con acqua sterile. Trappole bolla deve essere svuotato completamente tra ogni lavaggio. Questo può essere fatto mediante pompaggio in aria fino trappole bolla sono stati svuotati. Dopo lo svuotamento, togliere i tappi dalle trappole bolla prima di ricaricare il sistema. Rimettere i tappi dopo la bolla trappole sono state completamente riempita di liquido. Ripetere se necessario. </li><li> Esegui acqua sterile attraverso il sistema con un flusso basso (1-3 ml / h / canale) durante la notte o passare alla fase successiva. </li><li> Collegare la bombola di medie e di aspirazione e lavare il sistema con il mezzo durante la notte a bassa portata (3 ml / h / canale) alla temperatura in cui l&#39;esperimento verrà eseguito. Nota: le trappole bolla deve essere svuotato per l&#39;acqua prima che il sistema è pieno di media. </li></ol> 6. SEMINA DEL la cella di flusso <ol><li> Da un giorno all&#39;altro cultura fare una diluizione di una densità ottico desiderato (per esempio, P. aeruginosa 0,001 OD 600 nm e 0,1 OD 600nm per S. cerevisiae). </li><li> Utilizzare una siringa da 0,5 ml con un ago 27G per caricare inoculo sufficiente a riempire la camera. 250 microlitri è sufficiente per le camere di flusso che presentano le dimensioni specificate nel presente lavoro (Figura 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Fermare la pompa peristaltica. </li><li> Morsetto fuori il tubo di silicone che porta alla cella di flusso per impedire il riflusso nel sistema. </li><li> Sterilizzare l&#39;inoculazione sul tubo in silicone strofinandola con etanolo al 70%. </li><li> Inserire l&#39;ago nel tubo di silicone e introdurre la punta nella presa della cella di flusso. Iniettare lentamente l&#39;inoculo nella camera (attenzione a non iniettare bolle d&#39;aria). </li><li> Rimuovere l&#39;ago e pulire la sede di iniezione con etanolo al 70% seguita da immediata sigillatura del foro con colla siliconica sul sito di iniezione. </li><li> Capovolgere la cella a flusso e lasciare che i microrganismi aderiscono al substrato per 1 ora senza che il flusso attraverso la cella di flusso. </li><li> Girare la cella di flusso, avviare la pompa di media (3 ml / h / canale) e prendere la pinza dal tubo di silicone. </li><li> Il sistema è posto per l&#39;incubazione, a 37 ° C nel caso di P. aeruginosa e 30 ° C nel caso di S. cerevisiae. </li><li> Biofilm nelle camere a flusso possono ora essere visualizzati da CLSM. </li></ol> 7. COLORAZIONE di biofilm per la microscopia <ol><li> Fai una diluizione della colorazione appropriata (ad esempio 1:1000 Syto 9 vivere macchia di S. cerevisiae) </li><li> Fermare la pompa peristaltica. </li><li> Fascetta del tubo di silicone che porta alla cella a flusso. </li><li> Sterilizzare inoculazione sul tubo in silicone strofinandola con etanolo al 70%. </li><li> Utilizzare una siringa da 0,5 ml con un ago 27G per caricare soluzione abbastanza colorazione a riempire la camera. 250 microlitri è sufficiente per le camere flusso usato qui. </li><li> Inserire l&#39;ago nel tubo di silicone e introdurre la punta nella presa della cella di flusso. Iniettare lentamente la soluzione colorante nella camera (attenzione a non iniettare bolle). </li><li> Rimuovere l&#39;ago e pulire la sede di iniezione con etanolo al 70% seguita da sigillatura immediata del sito di iniezione. </li><li> Lasciare la cella di flusso senza flusso per 15 minuti. </li><li> Togliere il morsetto e avviare il flusso (3 ml / h / canale) </li><li> Acquisire dati con il CLSM </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo dimostrato un sistema a celle di flusso che rappresenta un potente strumento nelle indagini biofilm. In combinazione con immagini 3D con la microscopia confocale, il sistema ha una gamma di vantaggi rispetto ad altri metodi di analisi dei biofilm microbici mediante tecniche microscopiche più tradizionali. Questo sistema permette la visualizzazione in 3D di comunità vive biofilm microbico senza disturbo della comunità. Microscopia ottica non fornirà informazioni dettagliate sulle nicchie del biofilm e, mentre la microscopia elettronica fornisce una risoluzione nanometrica del biofilm, non permette l&#39;imaging dal vivo delle cellule. Utilizzando il sistema descritto canale di flusso abbiamo già chiarito la distribuzione spaziale delle cellule batteriche sensibili ai diversi antibiotici 5-8 (Figura 4a), la distribuzione dei composti extracellulari, come ad esempio il DNA 9-11 e la distribuzione di cellule mobili e non mobili di la stessa specie all&#39;interno di una comunità batterica 4,6,9 (Figura 4c). Prevediamo che il sistema di cella di flusso possono essere utilizzati per studiare gli aspetti di biofilm lievito. Questa potrebbe essere la distribuzione spazio temporale dei biofilm lievito in risposta a fattori ambientali come fungicidi così come l&#39;identificazione di geni coinvolti nello sviluppo di lievito biofilm. Anche se il lievito non è noto a differenziarsi in cellule mobili e non mobili, altri aspetti di diversificazione biofilm possono essere studi come il cambiamento morfologico dal lievito alle cellule pseudohyphal e il passaggio da aploide a cellule diploidi. Abbiamo dimostrato un sistema che rispettano diverse specie microbiche e lavorerà con tecniche di colorazione diverse. Una varietà di sonde di colorazione diversa e proteine ​​fluorescenti, come GFP, consentono indagini specifica nicchia nel biofilm di sviluppo ed è uno strumento efficace per analizzare l&#39;effetto degli agenti antimicrobici o di altri fattori ambientali. Le informazioni che si possono ottenere è molto dettagliata (Figura 4) e le caratteristiche nel biofilm può essere quantificato con programmi per computer come COMSTAT 12,13. Nel complesso, l&#39;aspetto più critico del protocollo è il fatto che si tratta di un processo che richiede tempo. E &#39;anche una limitazione che le cellule devono essere in grado di crescere in modo non fluorescente, superficie trasparente. . Dato che il biofilm formato viene analizzato con un microscopio confocale, la profondità che può essere indagato è limitata a qualche centinaio di micrometri 14 Ci sono ulteriori limitazioni tecniche inerenti alla progettazione: il sistema non è adatto per screening ad alto rendimento, come un ricercatore esperto in grado di gestire al massimo circa 15 canali per esperimento, che a sua volta può richiedere diversi giorni per prepararsi. Tuttavia, gli antibiotici o mutanti che sono considerati rilevanti per gli studi di biofilm può inizialmente essere messa a screening con altri metodi come macchie di cristallo viola prima che i candidati più interessanti sono trasferite al sistema di cella di flusso. Le lamiere di copertura in vetro sono molto sottili e si rompono facilmente, e si deve prestare attenzione durante la manipolazione del sistema. Inoltre i tubi dovrebbero essere esaminati ogni giorno durante la corsa di un esperimento, come una notevole &quot;back-crescita&quot; nei tubi di aspirazione a monte delle cellule flusso può verificarsi. Tale contaminazione può essere risolto rimuovendo diversi centimetri di tubo di silicone dal lato ingresso delle cellule di flusso, con tecnica sterile. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 a) quattro giorni PAO1 vecchia -. Biofilm GFP trattati per 24 ore con colistina e ioduro di propidio per la colorazione morti (macchia rossa) b) presentazione in 3D di una tre giorni di vecchio P. PAO1 aeruginosa (P. aeruginosa tipo selvatico) - GFP biofilm 6 c) immagine di presentazione in 3D di un PAO1 - CFP pila mutante (blu) con un tipo di PAO1 YFP selvatico (giallo), d) 5 giorno di vita PAO1 - GFP biofilm presentato come un 3D e immagine) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutante in CEN.PK sfondo) biofilm colorate con Syto-9 15.

<ul><li> Trappole Bubble, polietilene (DTU Systems Biology, Università Tecnica di Danimarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm 20Setup.aspx%%) </li><li> Connettori in plastica trasparente in polipropilene e T-connettori (Cole Parmer, 1 / 8 pollici (3,175 mm) e 1 / 16 pollici (1.588 mm)) </li><li> Morsetti </li><li> Microscopio confocale (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Coprioggetto, vetro (Knittel Gläser) 50 x 24 mm </li><li> Coprioggetto, PVC coprioggetti (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Celle di flusso, il polietilene (DTU Systems Biology, Università Tecnica di Danimarca, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm 20Setup.aspx%% </li><li> Bottiglie Media (Schott) </li><li> Pompa peristaltica (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rotolamento carrello per i sistemi di flusso e pompe </li><li> Silicone colla (3M Super Sigillante siliconico trasparente) </li><li> Siringa da 5 ml (Terumo) </li><li> Syto 9 (Molecular Probes) </li><li> 0,5 ml siringhe con aghi (27G, Terumo LU-100) </li><li> Contenitore dei rifiuti </li></ul> Tubi: <ul><li> Silicone, 3 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno (Ole Dich) </li><li> Silicone, 4 mm di diametro esterno, 2 mm diametro interno (Ole Dich) </li><li> Marprene, 3 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno (Watson-Marlow) </li></ul> Media <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa media </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 ml di 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 l / L metalli in tracce (per P. aeruginosa-biofilm) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mescolare A10 e FB in un rapporto di 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere la sorgente di carbonio ad una concentrazione desiderata. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae sintetico completo (SC) di media </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Solfato di adenina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-triptofano </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-istidina-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-arginina-HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-lisina HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-acido aspartico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> Acido L-glutammico </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Lievito NitRogen Base w / o aminoacidi e di ammonio (Bacto) </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> Solfato di ammonio </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> Acido succinico </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glucosio (autoclavato a parte) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

Cellule microbiche Molti hanno la capacità di formare comunità microbiche sessili definito come biofilm che hanno modificato le proprietà fisiologiche e patologiche rispetto ai microrganismi che vivono liberi. Biofilm in natura sono spesso difficili da indagare e di soggiornare in condizioni di scarsa definite 1. Utilizzando un substrato trasparente è possibile al dispositivo di un sistema in cui biofilm semplici possono essere esaminate in maniera non distruttiva in tempo reale: qui dimostriamo il montaggio e il funzionamento di un sistema di modello di flusso di cellule, per studi in vitro 3D dei biofilm microbici generando alta riproducibilità sotto ben definite condizioni di 2,3. Il sistema è costituito da una cella di flusso che funge da camera di crescita per il biofilm. La cella di flusso è fornito con sostanze nutritive e ossigeno da una fiaschetta di media tramite una pompa peristaltica e medio speso è raccolto in un contenitore dei rifiuti. Questa costruzione del sistema di flusso consente un approvvigionamento continuo di sostanze nutritive e la somministrazione di antibiotici ad esempio, con il minimo disturbo delle cellule coltivate in camera di flusso. Inoltre, le condizioni di flusso all&#39;interno della cella di flusso consentono studi di biofilm esposti a sollecitazioni di taglio. Una bolla cattura confini dispositivo di bolle d&#39;aria dal tubo che altrimenti potrebbe disturbare la struttura di biofilm nella cella di flusso. Il sistema di cella di flusso è compatibile con microscopio confocale a scansione laser (CLSM) e può quindi fornire informazioni molto dettagliate 3D sullo sviluppo biofilm microbici. Cellule del biofilm possono essere etichettati con sonde fluorescenti o proteine ​​compatibile con l&#39;analisi CLSM. Ciò consente la visualizzazione on-line e permette di indagine di nicchie nel biofilm via di sviluppo. Interrelazione microbica, indagine degli agenti antimicrobici o l&#39;espressione di specifici geni, sono delle configurazioni molti sperimentale che può essere indagato nel sistema di cella di flusso.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocollo che descrive l&#39;applicazione di un sistema di cella di flusso per la coltivazione e l&#39;analisi biofilm microbici per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.5K Views.  Danish Technical University. Protocollo che descrive l'applicazione di un sistema di cella di flusso per la coltivazione e l'analisi biofilm microbici per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM).

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilizzo Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesi Mariner Transposon-mediata

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...