Vorremmo ringraziare G. O Toole per la guida e suggerimenti per lo sviluppo di questi modelli. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fibrosi Cistica (ANDERS06F0 per GGA, STANTO07RO e STANTO08GA a BAS), il National Institutes of Health (T32A107363 per GGA e R01-HL074175 a BAS), e il Centro nazionale per le risorse Centri di Ricerca di Eccellenza di Ricerca Biomedica (COBRE P20-RR018787 di BAS).

1. Statico Co-cultura Biofilm Modello <ol><li> La statica Co-cultura Modello Biofilm 1 usa CFBE41o-cellule (cellule CFBE), che sono immortalate le cellule originariamente sviluppato da un individuo con omozigote CF per il ΔF508-mutazione CFTR 2,3,4. Cellule CFBE dovrebbe essere seminate ad una concentrazione di 10 6 cellule / pozzetto in un 6-pozzetti di coltura o 2 x 10 5 in un 24-pozzetti coltura tissutale in minima quantità di terreno essenziale (MEM) arricchito con 10% di siero fetale bovino, 2mM L-glutamina, 50 U / mL di penicillina, e 50 mg / mL di streptomicina. Noi usiamo 1,5 ml di mezzo per pozzetto in piastre da 6 bene e 0,5 ml di mezzo per pozzetto in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Le cellule devono essere coltivate a 37 ° C e 5% di CO2 -95% di aria per 7-10 giorni per formare un monostrato confluente prima inoculazione di batteri. Il mezzo deve essere cambiato ogni 2-3 giorni. Queste condizioni hanno dimostrato di portare alla formazione di un monostrato confluente e giunzioni strette. </li><li> Crescere P. aeruginosa in 5 LB mL per 18 ore a 37 ° C in un agitatore incubatore a 200 giri al minuto. In queste condizioni, P. culture aeruginosa in genere raggiungono una densità di 5x10 9 CFU / ml. </li><li> Per l&#39;inoculazione dei batteri, rimuovere il terreno dalle cellule CFBE e aggiungere un uguale volume di MEM senza rosso fenolo, integrato con 2 mM L-glutammina (medio Microscopy). CFBE monostrati confluenti vengono inoculate con P. aeruginosa in una molteplicità di infezione di circa 30:1 rispetto al numero di cellule CFBE originariamente seminati. Ciò equivale a 2 x 10 7 CFU / ml in 1,5 ml di MEM / bene per 6 pozzetti e 1,2 x 10 7 CFU / ml in 0,5 ml di MEM / bene per 24-pozzetti. </li><li> Incubare le piastre per 1 ora a 37 ° C e 5% -95% di CO2 nell&#39;aria. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1 ora, il sopranatante deve essere rimosso e sostituito con medium fresco Microscopia integrato con 0,4% arginina. </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% di CO2 -95% aria per intervalli di tempo diversi (fino a circa 8 ore) e analizzare l&#39;integrità del monostrato CFBE utilizzando il microscopio a contrasto di fase. Se le cellule delle vie aeree non sono confluenti, P. aeruginosa saranno rapidamente (pochi minuti) di accedere alla superficie basolaterale delle cellule e distruggere l&#39;integrità cellulare. Inoculazione con P. aeruginosa, i ceppi che esprimono costitutivamente risultati GFP in microcolonie biofilm fluorescente che può essere visualizzato mediante microscopia in epifluorescenza e confocale. </li><li> Il CFU batteriche nel biofilm può essere determinato lavando la co-coltura 2-3 volte con tampone fosfato salino (PBS) per eliminare i batteri planctonici. Dopo il lavaggio, trattare con 0,1% Triton X-100 in PBS o MEM per 10-15 minuti per lisare le cellule epiteliali e disperdere il biofilm. </li><li> Vortex per 3 minuti e preparare diluizioni seriali del lisato. Piastra di queste diluizioni su agar LB ed incubare una notte a 37 ° C. Contare le colonie il giorno seguente per determinare il CFU. </li></ol> 2. Cella di flusso co-cultura Biofilm Modello <ol><li> La cellula di flusso co-cultura Modello biofilm (test portata) comporta la modifica dello standard apparato cella a flusso biofilm per ospitare le cellule CFBE 5. </li><li> Luogo diversi coprioggetto di 40 mm di diametro in un bicchiere pulito becher da 100 ml. Coprire bene con 2 strati di fogli di alluminio e autoclave su un ciclo a secco per 20 minuti. </li><li> Lavorare in una cappa di coltura cellulare, afferrare uno coprioggetti sterile dal bicchiere con pinze etanolo lavato e posto in una sterile di 60 mm di diametro piatto di plastica. </li><li> Aggiungere 3 ml di pre-riscaldato media la crescita delle cellule, premendo sul vetrino con la punta della pipetta per rimuovere eventuali bolle intrappolate sotto e per forzare il coprioggetto sul fondo del piatto di plastica. </li><li> Semi di 2x10 6 celle per ogni piatto e agitare il piatto leggermente avanti e indietro. Evitare vorticoso per evitare centrifugazione le cellule contro i lati del piatto. </li><li> Porre la capsula in un 5% di CO 2 -95% incubatore d&#39;aria a 37 ° C e di alimentare le celle a giorni alterni con 3 ml di mezzo di crescita fresco per 8 a 10 giorni. Le cellule di formare un monostrato confluente sul coprioggetto di vetro. </li><li> Crescere P. aeruginosa in 5 ml di LB per 18 ore a 37 ° C in un agitatore incubatore a 200 giri al minuto. In queste condizioni, P. culture aeruginosa in genere raggiungono una densità di 5x10 9 CFU / ml. Noi usiamo P. PAO1 ceppo aeruginosa portando il pSMC21 plasmide per l&#39;espressione costitutiva della GFP 6. </li><li> Aggiungere 1 ml di coltura batterica in una provetta sterile. Centrifugare a 6000 rpm per 3 min, e lavare il pellet batterico due volte in 1 ml di terreno Microscopia. </li><li> Diluire 0,5 ml di batteri lavate e risospese in 4,5 ml di mezzo di microscopia per ottenere una concentrazione di circa 5x10 8 CFU / ml. </li><li> Osservazione di cellule vivein tempo reale richiede una camera di imaging accoppiato ad una pompa peristaltica (per garantire un flusso di nutrienti per periodi di tempo) e un regolatore di temperatura. Usiamo il FCS2 Bioptechs (Focht Live-Cell) camera collegata ad un basso flusso di micro-perfusione pompa con 1 / 16 ° C-flex taglio tubi di lunghezza appropriata e autoclave per la sterilità, e la temperatura regolata tramite il controller della camera FCS2. Manteniamo la fonte di ingresso di media in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C situato proprio accanto al microscopio. </li><li> Montare la camera di flusso. La camera di FCS2 comprende un autobloccante base (che si siede sul palco durante l&#39;adattatore di imaging) e di una metà superiore collegato ai tubi perfusione e il controller della camera. La camera è montata a testa in giù prima di essere capovolto e posizionato sull&#39;adattatore palco. Tenere la parte superiore della camera a testa in giù in modo che i tubi di perfusione sono visibili, e allineare i fori di distanza di una guarnizione in gomma pari a 0,75 mm di spessore sul tubi di perfusione. Pila la diapositiva microaqueduct fornito con la camera in cima alla guarnizione in gomma, assicurandosi che il lato scanalato è alto, e posto un altro guarnizione in gomma sulla parte superiore della diapositiva. Lo spessore e la geometria interna di questa seconda guarnizione determinerà il volume della camera. Noi di solito lavorare con un 0,75 mm di spessore con guarnizione in gomma da 30 mm geometria tondo interno. </li><li> Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) media Microscopia al centro della diapositiva. </li><li> Recupero di una 60 mm piatto dalla cella cultura incubatore, rimuovere il supporto spesi e lavare le cellule una volta con 3 ml di pre-riscaldato medio Microscopia. Questo passaggio garantisce l&#39;eliminazione del rosso fenolo e antibiotici presenti nel terreno di coltura delle cellule. Rosso fenolo è leggermente fluorescente e può interferire con le immagini, mentre gli antibiotici possono sradicare P. aeruginosa batteri prima di poter stabilire biofilm. </li><li> Utilizzando etanolo lavato pinze, recuperare il coprioggetto dal piatto e basso a testa in giù sul tallone di media Microscopia posto sulla camera. Il coprioggetto è ora di riposo sulla guarnizione in gomma secondo e il monostrato di cellule delle vie aeree è rivolto verso il basso. </li><li> Tenendo i componenti assemblati in una mano, posto alla base della camera in cima alla pila, e girare la camera di sopra rapidamente in modo che tutto sia lato destro alto. Bloccare la base in posizione ruotando l&#39;anello. </li><li> Collegare il tubo di ingresso al basso flusso di micro-perfusione pompa e avviare il flusso a una velocità di 20 ml / h; questa portata è alla portata di nuoto velocità di P. aeruginosa. Un secondo pezzo di tubo della pompa link ad un fiasco di media Microscopia posto nel bagno d&#39;acqua a 37 ° C situato proprio accanto al microscopio. </li><li> Allega sterile pre-tagliati 1 / 16 ° C-Flex tubi di aspirazione e tubi di perfusione uscita della camera, collegare il regolatore di temperatura, poi posto la camera montata sul palco microscopio di un microscopio invertito a fluorescenza. </li><li> Utilizzando un 1-ml siringa monouso, iniettare la sospensione batterica precedentemente preparato nella camera, utilizzando una valvola a due vie posto in linea tra la pompa e la camera. Nel nostro ambiente particolare, ci vuole un volume di 0,6 ml di sospensione batterica per raggiungere la camera. Regolare il volume in base alle proprie lunghezza del tubo particolare. Troviamo anche utile porre un filtro in linea monouso 0,22 micron filtro tra la pompa e la valvola a due vie per impedire ai batteri di nuoto controcorrente e contaminando il pallone d&#39;ingresso. </li><li> Per consentire ai batteri di attaccare le cellule delle vie aeree, fermare la pompa per 2h. Il flusso può poi ricominciare e mantenuta a 20 ml / h per il resto l&#39;esperimento. </li><li> Monitorare l&#39;integrità delle cellule delle vie aeree per contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia tutto l&#39;esperimento per verificare eventuali segni di danni al monostrato. Allo stesso tempo, seguire lo sviluppo della GFP-etichettata P. aeruginosa biofilm sulla superficie apicale delle cellule delle vie aeree con l&#39;acquisizione di immagini con un microscopio invertito a fluorescenza o confocale a grande campo. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati Usiamo un ceppo di P. aeruginosa pSMC21 contenente il plasmide che permette di espressione costitutiva di GFP 6. Per questo motivo, GFP-etichettata biofilm cresce su un monostrato CFBE possono essere visualizzati mediante microscopia in epifluorescenza. In alternativa, la visualizzazione del biofilm può essere raggiunto con la colorazione senza etichetta P. aeruginosa con un 1% di soluzione calcofluor bianco per 1 ora a 37 ° C 1. Per la formazione di biofilm immagini sulle cellule CFBE nel test di flusso, si usa una misura adattatore stadio, ma più aziende possono ora fornire adattatori palco appositamente montato. Lavoriamo con un microscopio Olympus IX70 invertito dotato di un ORCA-AG profondo raffreddamento telecamera CCD e un olio x60-immersion obiettivo (apertura numerica 1,40). Il filtro wtallone è equipaggiato con un filtro di banda 480/40 nm di eccitazione e di un passaggio 535/30 nm filtro passa-banda di emissione. Le immagini digitali sono state acquisite con il pacchetto software 4.0.3 OpenLab (improvvisazione) ei volumi sono stati deconvolved da iterativo di restauro utilizzando il software 3.5.1 Volocity (improvvisazione). Analisi quantitativa delle strutture biofilm 3D è stato raggiunto con il pacchetto software di analisi dell&#39;immagine COMSTAT 7,8. Per qualsiasi co-coltura modello considerato, si deve prestare particolare attenzione alla citotossicità sviluppo tra i componenti del modello. In entrambi i test statici e il flusso delle cellule, abbiamo scoperto che il monostrato CFBE potrebbe sopportare la presenza di P. aeruginosa fino a 8 ore dopo l&#39;inoculazione, senza alcun segno di alterazione. Integrità monostrato epiteliale può essere valutata in contrasto di fase microscopio utilizzando un microscopio invertito 1 (Figura 1A) o da interferenze contrasto differenziale (DIC) microscopia tutto l&#39;esperimento 5. Nel corso del tempo, P. aeruginosa produce tossine e fattori di virulenza che si accumulano e possono danneggiare il monostrato di cellule epiteliali in tutto o in sezioni (Figura 1B-1C). Citotossicità può essere valutata quantitativamente con vari kit per misurare il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) dalle cellule epiteliali. LDH è un enzima citosolico stabile rilasciata nell&#39;ambiente extracellulare su lisi cellulare o morte cellulare. Quando l&#39;integrità del monostrato vie aeree non è compromessa (tipicamente per ~ 8 ore dopo l&#39;inoculazione), P. biofilm aeruginosa possono formare e sviluppare con successo sulla superficie apicale delle cellule delle vie aeree sia in co-coltura modelli descritti (Figura 2A-2B). A seguito di ricostruzione 3D (Figura 2C) e la quantificazione, l&#39;accumulo di biomassa può essere accuratamente determinato. Abbiamo anche utilizzato questi co-coltura biofilm in diversi test fenotipici. Per esempio, come già detto, biofilm CFU può essere facilmente determinata dalla lisi delle cellule epiteliali, in serie diluire il lisato, e placcatura su piastre di agar. Abbiamo trovato questa tecnica vantaggiosa nel determinare la resistenza di diversi ceppi di trattamento antibiotico. Inoltre, la tossicità biofilm verso le cellule epiteliali può essere misurato utilizzando disponibili in commercio kit di rilevazione LDH. In questo modo, il ruolo dei fattori di virulenza della tossicità dei biofilm può essere valutata. Questi sistemi di modelli supportano anche una serie di applicazioni di espressione genica, compresi gli studi fusione promotore, RT-PCR e analisi microarray 1,5,9. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Monostrato di cellule CFBE e immagini rappresentative di compromesso e danneggiato monostrati di cellule delle vie aeree a causa di P. aeruginosa crescita biofilm. (A) immagine rappresentante di un monostrato di cellule confluenti CFBE coltivate in piastre di coltura tissutale, valutata in contrasto di fase microscopia. Scala grafica, 120 micron. (B) Esempio di un monostrato CFBE compromessa. Anche se il monostrato non mostra evidenti segni visibili di danni ancora, P. aeruginosa batteri sono visti diffondendo tra le giunzioni strette delle cellule epiteliali e guadagnando l&#39;accesso alle membrane basolaterale. Formazione di biofilm non è in genere raggiunto in queste condizioni a causa del deterioramento monostrato. Scala grafica, 20 micron. (C) Esempio di un invaso P. biofilm aeruginosa osservato 24 ore dopo l&#39;inoculazione. Dopo il successo sostenendo la formazione di biofilm, il monostrato CFBE è stato danneggiato in modo irreparabile e ora è praticamente assente. Biofilm residuo, crescendo come uno strato piatto di batteri, viene mostrato inerenti alle coprioggetto di vetro. Scala grafica, 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. P. biofilm aeruginosa cresciuto sulla superficie apicale delle cellule CFBE confluenti con il Co-Static cultura Modello Biofilm e la cella di flusso co-cultura Modello biofilm. (A) l&#39;immagine di un rappresentante GFP che esprimono P. aeruginosa biofilm cresciuti su un monostrato di cellule confluenti CFBE utilizzando la statica Co-cultura Modello biofilm, valutata mediante microscopia in epifluorescenza. L&#39;immagine è una sovrapposizione del canale di contrasto di fase e il canale di fluorescenza. Scala grafica, 35 micron. (B) l&#39;immagine di un rappresentante GFP-etichettata P. biofilm aeruginosa coltivato per 6 ore su un monostrato di cellule confluenti CFBE utilizzando la cella di flusso co-cultura Modello biofilm. Per facilitare la visualizzazione del monostrato delle vie aeree, i nuclei sono stati colorati con 10 mcg / mL di Hoechst 33342 (Molecular Probes) per 30 minuti prima dell&#39;inoculo con P. aeruginosa. Immagini fuse e pseudocolored sono stati visti per contrasto di interferenza differenziale (DIC), e le immagini corrispondenti fluorescenti sono mostrati. Biofilm, si presenta come grumi verde attaccato alla superficie apicale delle cellule CFBE, si disperdono attraverso le cellule delle vie aeree. Scala grafica, 20 micron. (C) tridimensionale ricostruzionezione di z-stack serie di immagini che mostrano il tipico fungo-come le strutture di 6 h-vecchio P. biofilm aeruginosa che formano un monostrato cellulare CFBE. Scala grafica, 10 micron.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I biofilm sono comunità di batteri che si formano in risposta a stimoli ambientali. Questi segnali ambientali globali portare a cambiamenti normativi all&#39;interno di ogni batterio, con conseguente legame ad una superficie, l&#39;aggregazione, la produzione di esopolisaccaridi, e altri fenotipi quali aumento della resistenza agli antibiotici 10. Nel corso degli ultimi due decenni, molte prove ha sostenuto l&#39;ipotesi che i biofilm giocano un ruolo importante nella patogenesi delle infezioni croniche. Per...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS2 (Focht Live-Cell) chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319131616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS2 chamber controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319-2-0303</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 mm glass coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>PH 40-1313-0319</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>#10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM without phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

co-culture models of pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells

Biofilm batterici sono stati associati con una serie di diverse malattie umane, ma lo sviluppo di biofilm è stata generalmente studiata su superfici non viventi. In questo articolo, si descrivono i protocolli per la formazione di biofilm Pseudomonas aeruginosa sulle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane (cellule CFBE) crescere in coltura. Nel primo metodo (chiamato la statica Co-cultura Modello biofilm), P. aeruginosa viene incubata con cellule CFBE cresciuto come monostrati confluenti su piastre standard di coltura dei tessuti. Anche se il batterio è molto tossico per le cellule epiteliali, l&#39;aggiunta di ritardi arginina la distruzione del monostrato abbastanza a lungo per formare biofilm sulle cellule CFBE. Il secondo metodo (chiamato la cella di flusso co-cultura Modello biofilm), comporta l&#39;adattamento di un apparato cellulare biofilm flusso, che è spesso usato in biofilm ricerca, per ospitare un coprioggetto di vetro sostenere un monostrato di cellule confluenti CFBE. Questo monostrato viene inoculato con P. aeruginosa e una pompa peristaltica scorre mezzo fresco attraverso le cellule. In entrambi i sistemi, i biofilm batterici forma entro 6-8 ore dopo l&#39;inoculazione. Visualizzazione dei biofilm è migliorata con l&#39;uso di P. aeruginosa, i ceppi che esprimono costitutivamente la proteina fluorescente verde (GFP). La statica e Cella di flusso co-cultura saggi biofilm sono sistemi modello per l&#39;inizio del P. infezione aeruginosa della fibrosi cistica (CF) del polmone, e queste tecniche permettono diversi aspetti di P. formazione di biofilm aeruginosa e virulenza da studiare, tra citotossicità biofilm, la misurazione di biofilm CFU, e la colorazione e la visualizzazione del biofilm.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Questo articolo descrive diversi metodi di coltivazione<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Biofilm su colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane. Questi protocolli possono essere adattati per studiare i diversi aspetti della formazione di biofilm, compresa la visualizzazione del biofilm, colorazione del biofilm, la misurazione della unità formanti colonia (CFU) del biofilm, e studiare la citotossicità biofilm.

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

co-culture-models-pseudomonas-aeruginosa-biofilms-grown-on-live-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

22.1K Views.  Dartmouth College. Questo articolo descrive diversi metodi di coltivazione Pseudomonas aeruginosa Biofilm su colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane. Questi protocolli possono essere adattati per studiare i diversi aspetti della formazione di biofilm, compresa la visualizzazione del biofilm, colorazione del biofilm, la misurazione della unità formanti colonia (CFU) del biofilm, e studiare la citotossicità biofilm.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

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Immunologia e infezioni

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.