Ringraziamo il Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) per la progettazione piastra di testa. Il lavoro è stato sostenuto da premi NIH a SD (R01DA026325 e P30AI078498 e sovvenzioni per KK (DANA Brain Foundation e del programma Immunoimaging, American Heart Association 0635595T e l&#39;Associazione ALS [# 1112)]).

1. Preparare l&#39;animale per l&#39;imaging Nota: Usiamo C57BL topi adulti. Diversi ceppi transgenici possono essere utilizzati a seconda della domanda di ricerca. Ambulatori microvascolari e pulsossimetria sono facilitati nei topi con pelliccia bianca (ad es ceppo FVB). <ol><li> Preparare il sito chirurgico al banco. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere autoclavati o disinfettati con il 70% di etanolo. </li><li> Inserire una sonda rettale, e misurare costantemente la temperatura corporea dell&#39;animale durante tutta la procedura </li><li> Anestetizzare il mouse utilizzando inizialmente il 5% isoflurano. In 15-30 s, quando l&#39;animale non si muove, appoggiarlo su una piastra elettrica (37 ° C), e applicare una maschera facciale per la fornitura continua di aria contenente 1,3-1,5% isoflurano). Assicurarsi che l&#39;animale non risponde a uno stimolo del dolore (ad esempio, un pizzico di coda). </li><li> Utilizzare lacrime artificiali gel per coprire gli occhi del topo, per evitare l&#39;esposizione all&#39;aria secca. </li><li> L&#39;utilizzo di un rasoio elettrico, rimuovere f capellirom la testa e da entrambe le cosce. Applicare Epilatore (ad esempio Nair) alla coscia per 2 minuti, quindi asciugare con cura per eliminare la peluria restante. Questa coscia verrà utilizzato per ossimetria. </li><li> Disinfettare il cuoio capelluto con un 10% di povidone-iodio e soluzione di etanolo al 70%. </li></ol> 2. Preparazione della finestra aperta cranio cranica <ol><li> Avvio di 5 millimetri al cranio caudale, fare un&#39;incisione nel cuoio capelluto con le forbici, e avanzare di un centimetro. Spostare la pelle ai lati per esporre il cranio. </li><li> Per rimuovere le membrane sulla sommità del cranio applicare 10% soluzione di cloruro ferrico all&#39;inizio del cranio. Eliminare la soluzione in eccesso, e raschiare le membrane via con angolo di 45 ° # 5 pinzette. È importante preparare il sito accuratamente, in modo da assicurare che la piastra di testa può essere saldamente fissato al cranio (passi # 4-6). </li><li> Utilizzando un microscopio di dissezione, identificare l&#39;area di interesse. Si noti che le suture craniche devono essere evitate perché il cranio cuna pausa imprevedibilmente lungo queste linee. </li><li> Applicare uno strato sottile di collante rapido (ad esempio Locktite 454) intorno ai bordi della finestra della piastra di testa (figura 1). Posizionare la piastra di testa in modo tale che l&#39;area di interesse è esposta nella finestra. Applicare una leggera pressione sulla piastra di testa. Applicare una piccola quantità di cemento dentale per polimerizzare la colla rapidamente. Mantenete la posizione per 10 secondi mentre la colla si polimerizzazione. </li><li> Applicare una piccola quantità di colla rapido ai bordi della finestra per sigillare la piastra di testa e il cranio. Avvitare la piastra di testa al titolare degli animali nell&#39;ambito di applicazione dissezione. </li><li> Con il trapano Microtorque II fissato a 6.000 rpm e una punta da trapano 005 IRF, rimuovere tutti i colla extra dal cranio e dalla piastra di testa. Qualsiasi residuo di colla sulla piastra di testa deve essere rimosso, in quanto altrimenti interferire con l&#39;aggancio del coperchio di vetro. </li><li> Impostare il trapano a 1000 rpm, e cominciare a forare il cranio facendo un cerchio all&#39;interno della finestra di piastra di testa, diametro ~ 5 mm. Utilizzare leggeri movimenti ampi, come se si disegna con una matita molto morbida. Stop foratura ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere ossea con aria compressa. Nota: La forma della sua apertura nella piastra di testa consente un ulteriore accesso per la punta (per il chirurgo di sinistra e mano destra), che rende più semplice per creare una finestra circolare cranica. Inoltre, i due fori sagomati dispari fornire lo spazio necessario per inserire un Clark-elettrodo o elettrodo di vetro nel tessuto cerebrale sotto la finestra cranica per ulteriori misurazioni polarografiche o elettrofisiologico. </li><li> Mentre la perforazione progredisce, un cunicolo è formata attorno al cranio intatto nel centro. Fare attenzione a non colpire attraverso il cranio assottigliato, ma per fare questo tana di spessore uniforme. Prestare attenzione extra intorno grandi vasi del sangue, che non dovrebbe essere compromesso e, se possibile, nemmeno toccato. </li><li> Utilizzare una &quot;gamba&quot; di pinzette # 3 a sollevare (&quot;flick off&quot;) l&#39;osso al centro della finestra. Applicare una goccia di artificIAL liquido cerebrospinale (ACSF) sulla finestra. </li><li> Pulire ACSF delicatamente con un angolo di carta dei tessuti molli (ad esempio Kimwipe). Normalmente la dura madre è danneggiato in uno o più posti intorno al bordo della finestra. A partire da uno di questi siti, sollevare delicatamente e quindi rimuovere la dura dalla superficie del cervello, con angolo di 45 ° pinzette # 5. Nella scelta del luogo da cui iniziare la rimozione della dura, evitare le zone adiacenti alle grandi vasi sanguigni. Se il sanguinamento si verifica, applicare una goccia di ACSF e attendere per 2-3 minuti per sanguinamenti minori di fermarsi. </li><li> Preparare 0,07% agarosio a basso punto di fusione disciolto in ACSF) Portare il fuso agarosio a temperatura corporea. Eliminare l&#39;eccesso di ACSF dalla superficie del cervello. Versare l&#39;agarosio nella finestra, e coprire con un vetrino. Premere il vetro delicatamente per fare un contatto tra il vetro e la piastra di testa, e attendere 10-20 sec finché l&#39;agarosio è solido. </li><li> Togliere l&#39;eccesso di agarosio dal coperchio di vetro con una pinzetta e la carta dei tessuti molli. </li><li> Mettete una piccolaquantità di colla rapida attorno al vetro per incollare il vetro alla piastra testa. Applicare una piccola quantità di cemento dentale per solidificare la colla (Figura 1). </li></ol> 3. L&#39;iniezione endovenosa di monitoraggio e l&#39;ossigenazione del sangue Nota: Abbiamo utilizzato di routine nella vena femorale per somministrazione endovenosa del Texas rosso piuttosto che la vena della coda. Questo perché iniezioni vena femorale fornire boli sicuri e riproducibile del colorante. <ol><li> Girare l&#39;animale parzialmente con il passare per esporre l&#39;interno della coscia sinistra. Utilizzare nastro per fissare l&#39;animale in questa posizione. </li><li> Applicare scrub antisettico, e quindi etanolo al 100% alla pelle. </li><li> Praticare un&#39;incisione lungo la coscia mediale dal ginocchio alla sinfisi pubica. Separare i tessuti molli per via smussa con una pinzetta # 5. </li><li> Riempire la siringa da 1 ml con 130 pl di Texas Red (2,5 mg / ml). Inserisca un nuovo ago (calibro 30), e piegare con cura a 30 °, mantenendo il smussata. Riempire il wi agoth Texas Red soluzione. </li><li> Sotto un microscopio a dissezione, inserire l&#39;ago nella vena femorale e iniettare 100 microlitri di Texas Red. Rimuovere l&#39;ago e premere leggermente la vena con una garza per fermare le emorragie. </li><li> Chiudere la pelle con filo di sutura 4-0. </li><li> Per il monitoraggio continuo di sangue SpO 2 (per assicurare un&#39;adeguata ossigenazione del sangue), posizionare la sonda ossimetro sulla coscia destra (da cui è stato precedentemente rimosso i capelli). </li></ol> 4. Due fotoni di imaging Nota: utilizzare un Olympus Fluoview1000 multiphoton sistema di imaging (verticale) con una Spectra-Physics femtosecondi Maitai Ti HP DeepSee: Sa laser come sorgente di eccitazione. Per l&#39;imaging, usiamo × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat) o × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) acqua-immersion obiettivi. Prendiamo le immagini a 12 bit di profondità con una risoluzione di 512 × 512 pixels con un pixel tempo di permanenza di 2 ms. Il NADH e Texas-Red-destrano vengono contemporaneamente eccitate a 740 nm, e la Fluorescence è separato dalla luce di eccitazione usando uno specchio dicroico / vicino-IR-blocco filtro combinato (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) divisa in due canali usando uno specchio dicroico (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA) e sulla banda passante filtrata (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Potenza del laser misurata dopo l&#39;obiettivo era 10-20 mW per l&#39;imaging in layer I e 20-50 mW per l&#39;imaging nello strato II. <ol><li> Trasferire il mouse chirurgicamente preparato alla fase microscopio. Prendete un quadro iniziale del sito finestra cranica con forte illuminazione campo ad un ingrandimento di 4x da utilizzare come mappa di riferimento per la registrazione con un ingrandimento maggiore di due fotoni angiografie. </li><li> Ingrandire l&#39;area di interesse utilizzando × 10 ingrandimenti. Selezionare un&#39;area di interesse in strati corticali I o II (fino a 150 micron sotto la superficie piale). Se si desidera un ingrandimento maggiore, utilizzare × 25 obiettivi </li><li> Inizio della registrazione delle serie temporali (Figuri 2). Si consiglia di utilizzare una media di 3-5 frame per aumentare la qualità dell&#39;immagine. </li><li> Indurre ipossiemia con l&#39;aggiunta di 50 sulla N2 per l&#39;aria che l&#39;animale sta respirando. Questo porterà il livello di O2 al 10%. Verificare ipossiemia da dati di monitoraggio ossimetro. </li><li> Continuare a registrare il tempo attraverso ipossiemia serie (ad esempio, per 30 secondi), e dopo il normale livello di O2 viene ripristinato. </li><li> Raccogliere dati per il calcolo della distribuzione dell&#39;ossigeno rilevando, misurando e quantificare la superficie dei cilindri tessuto ipossia e ossigenato i vasi sanguigni. </li></ol> 5. Elaborazione dei dati <ol><li> Determinare il Krogh tessuto cilindro raggio R. Questo può essere fatto manualmente (figura 3), misurando la distanza tra il centro del vaso sanguigno e il confine in cui viene rilevato alta fluorescenza NADH. </li><li> In alternativa, utilizzare il calcolo investigatore indipendente semi-automatica determinazione del cilindro di raggio R del tessuto e la BLO centraler nave od che è stato descritto in precedenza 1 in forma supplementare ed è riassunta nella sezione dedicata alla discussione di questo protocollo. </li><li> Determinare l&#39;area di ipossia con un accesso aperto a software di analisi dell&#39;immagine, ad esempio ImageJ. Per fare questo, utilizzare il segnale NADH, definire una soglia che delinea un&#39;area ad alta intensità di NADH, e quindi misurare la zona con elevata fluorescenza dei tessuti NADH. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi La figura 2 mostra il video di NADH / angiografia immagini durante ipossiemia transitoria (per la versione PDF di questa figura, selezionate le immagini fisse sono state utilizzate). La concentrazione di ossigeno inspirato è stata abbassata dal 21% al 10% per un periodo di 3 min. Questo livello di ipossiemia sperimentalmente indotta è sufficiente ad indurre ipossia grave nella corteccia cerebrale. L&#39;ipossia portato a un aumento di fluorescenza NADH, inizialmente nelle zone che erano più lontana dalla fornitura di sangue arterioso. Nota: il tessuto forte NADHconfini, che rappresentano i confini dei tessuti osservabili di diffusione dell&#39;ossigeno dalla microcircolazione corticale. L&#39;immagine della Figura 3 mostra la geometria dei confini diffusione dell&#39;ossigeno circostanti vasi cerebrali. È possibile dedurre Krogh diametro del cilindro da questi limiti, come descritto in precedenza 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Mouse con finestra cranica preparato per l&#39;imaging. (B) Dimensioni piastra di testa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> Figura 2. Endogena NADH fluorescenza verde visualizzata con due fotoni di imaging attraverso la finestra del cranio, circa 50 micron sotto la superficie piale. I vasi sanguigni sono visualizzati con Texas Red destrano. L&#39;ossigeno in aria inalata è stata ridotta al 10% per 3 min, e poi ripristinata per il 21%. Barra della scala: 50 micron. &lt;img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Geometria di NADH confini fluorescenza. Sagoma gialla indica limite di ipossia funzionale; cerchi blu mostrano proiettate ossigenata (Krogh) cilindri. Le linee blu indicano i raggi del cilindro; numeri mostrano raggi in micrometri.

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	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Informazioni ad alta risoluzione spaziale sulla diffusione dell&#39;ossigeno è importante per capire come il flusso di sangue nel cervello è regolato per fornire ossigeno alle cellule cerebrali, e per soddisfare la domanda metabolica. Tradizionali misure di ossigeno polarografiche con Clark in stile elettrodi di vetro sono altamente invasivi e hanno una bassa risoluzione spaziale 2-3 e tempo di risposta significativa (secondo intervallo). Finora l&#39;unico metodo non invasivo per la misurazione della pO 2 nel tessuto cerebrale è quenching fosforescenza, dove il tasso di decadimento della sonda eccitato è proporzionale alla concentrazione di ossigeno 4. Questo metodo fornisce concentrazioni di ossigeno accurate, ma richiede un colorante di proprietà e una fosforescenza tecnicamente sofisticato sistema di imaging vita. Qui, dimostrano un approccio semplice e più semplice che può essere condotta su uno standard a due fotoni sistema di imaging con due canali flurescence. Il nostro approccio si avvale di un segnale tessuto intrinseca 5 bisnd richiede solo la visualizzazione di contrasto della microcircolazione corticale. A causa della non-lineare, aumento essenzialmente binario di NADH fluorescenza a funzionalmente limitare concentrazioni di ossigeno 1, aumentata fluorescenza intrinseca NADH è stata osservata solo in aree con significativa, ipossia metabolicamente limitativo. Un&#39;importante implicazione è che i confini dei tessuti di diffusione dell&#39;ossigeno da microvasi corticali sono direttamente osservabili dalle variazioni di intensità cilindrica a forma di fluorescenza endogena NADH. Ci riferiamo a queste strutture come cilindri Krogh, perché il concetto di strutture a forma cilindrica che definiscono il volume ossigenato di tessuto che circonda un vaso sanguigno è stato introdotto da August Krogh ed è stato recentemente osservato sperimentalmente con due fotoni NADH immagini 1. Cilindri Krogh immagini possono essere raccolte in 3D prendendo una z-pila di fotogrammi dell&#39;immagine. Sono particolarmente importanti in prossimità di arteriole penetranti e sono spirito congruoh capillare impoverito periarteriolar cilindri 1,4 tessuti. Per fornire una determinazione obiettivo del raggio R tessuto Krogh cilindro (v. punto 5.2) sono stati misurati i valori di intensità dei pixel radiali all&#39;interno di una ben definita segmento tra il centro del cilindro e il contorno esterno utilizzando la funzione di Matlab &quot;improfile&quot;. Il contorno esterno del segmento dovrebbe essere scelto per estendere con un margine di sicurezza al di là del limite visibile. Per migliorare il rapporto segnale-rumore livello che averageed su tutte le linee radiali necessari per coprire il segmento visibile cilindro a passi di 1 °. La risultante profilo di intensità media radiale all&#39;interno del segmento mostrato un forte aumento che corrispondeva al confine R visibile tessuto. Il abbiamo adattare una funzione sigmoidale (es funzione Boltzmann) al profilo di intensità mediati radiale e usato suo punto di flesso (noto anche come x 0) come definizione di R. Il corrispondente a due photon microangiography (Texas-rosso) hanno rivelato la sezione trasversale di un vaso sanguigno solitario centrale nel centro del cilindro. Il diametro del vaso sanguigno centrale può essere direttamente applicato per determinare r. Due fotoni NADH immagini offre la stessa risoluzione spaziale come la concomitante imaging ad alta risoluzione del microangiography corticale. Una caratteristica importante per l&#39;applicazione quantitativa di questo metodo è che p 50 del NADH aumento di fluorescenza è stata misurata per essere di 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 e che l&#39;intensità di NADH fluorescenza in funzione del tessuto microregionale pO 2 può essere matematicamente descritto con una funzione sigmoidale. . Abbiamo dimostrato che questa tecnica permette di identificare le aree cerebrali che sono più vulnerabili a ipossia (diminuendo il contenuto di ossigeno nell&#39;aria al 10%). Mostriamo anche che la diffusione di ossigeno segue un modello semplice perivascolare geometrico. Una critpasso iCal per questo metodo è la qualità della preparazione finestra cranica. La chirurgia dovrebbe produrre un danno minimo per non disturbare il flusso di sangue alla zona esposta. Una preoccupazione è che in una preparazione chirurgicamente compromesso, la corteccia sotto la finestra può essere ipossico per cominciare, precludendo qualsiasi esperimenti significativi. A ben preparato finestra cranica dovrebbe avere intatte vasi sanguigni maggiori e minori, con il flusso di sangue vivido in tutti i tipi di navi e nessun sanguinamento significativo lungo i bordi. In condizioni di normossia (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%), il parenchima cerebrale deve presentare uniforme, fluorescenza omogenea NADH cospicui, senza chiazze luminose con tessuti a fluorescenza NADH elevata. Un vincolo fisico fondamentale del nostro approccio è limitata penetrazione in profondità. Il blu-verde fluorescenza NADH nel cervello è rapidamente attenuato di scattering e di assorbimento dell&#39;emoglobina tessuto a queste lunghezze d&#39;onda. Anche con elevata apertura numerica (per esempio 1,05) acquaobiettivi ad immersione a due fotoni NADH immagini è attualmente limitata a strati corticali I e II. Questa limitazione è scientificamente rilevante in quanto il metabolismo energetico o in prossimità di materia bianca sarà probabilmente diverso dalla materia grigia. Tuttavia, l&#39;indagine di profonde strutture corticali come strati IV-VI o strutture sottocorticali quali tratti di sostanza bianca o striato richiederebbe l&#39;uso di microlenti specializzati come descritto nella corteccia topo in vivo 6. NADH-based misurazione dei confini di diffusione di ossigeno può essere particolarmente utile se combinato con altre misure, quali analisi di iperemia funzionale, e la rilevazione dei tassi di flusso capillare 7. Ad esempio, questa tecnica può essere adattato per visualizzare ipossia in ictus e malattia di Alzheimer (AD) modelli. La geometria semplice diffusione di ossigeno permette di prevedere il gradiente di ossigeno nel letto microvascolari in circostanze in cui la densità capillare è deaumentata 8 (per esempio, AD 9) e di esaminare se le regioni di tessuto cerebrale con ridotta densità capillare sono ad aumentato rischio di danni a causa di ipossia microstrokes. La capacità di immagine microregionally permette anche di esaminare la geometria e le dimensioni dei microstrokes tessuti e determinare il volume del tessuto in cui si verifica ipossia, nonché il rapporto tra ipossia tissutale e successiva morte neuronale o rimodellamento capillare 10. Infine, dato che aumenta a fluorescenza endogena NADH sono la conseguenza diretta di acuta disfunzione mitocondriale, questo metodo crea l&#39;opportunità di utilizzare l&#39;imaging NADH come reporter specifico per il metabolismo energetico neuronale 11 e un proxy per la disfunzione mitocondriale. In conclusione, a due fotoni immagini di fluorescenza endogena NADH è uno strumento semplice, poco impegnativo che può essere utilizzato per comprendere l&#39;apporto di ossigeno e il consumo nel cervello normale sia sottoe negli stati patologici.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Riscaldamento pastiglie </td><td> Al di là di calore Bodi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Unguento oftalmico (lacrime artificiali) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidone-iodio soluzione al 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro ferrico 10% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cemento </td><td> Stoelting Società </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cianoacrilato 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ACSF </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II manipolo kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 Punte </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza # 5 </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza # 5/45 </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 vetrino coprioggetto </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo fotomoltiplicatore </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Sapphire laser Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

La capacità del cervello di funzionare ad alti livelli della domanda metabolica dipende dalla fornitura di ossigeno continuo attraverso il flusso di sangue e di ossigeno la diffusione dei tessuti. Qui vi presentiamo un protocollo sperimentale, visualizzato e metodologici per visualizzare direttamente microregionale ipossia tissutale e di dedurre gradienti di ossigeno perivascolari nella corteccia mouse. Essa si basa sulla relazione non lineare tra nicotinammide adenin dinucleotide (NADH) endogeno intensità di fluorescenza e la pressione parziale di ossigeno nel tessuto, dove osservato tessuto NADH fluorescenza aumenta bruscamente a livelli tissutali di ossigeno inferiore a 10 mmHg 1. Usiamo due fotoni eccitazione a 740 nm che permette per l&#39;eccitazione contemporanea di fluorescenza intrinseca del tessuto NADH e plasma sanguigno in contrasto con Texas Red-destrano. I vantaggi di questo metodo rispetto agli approcci esistenti sono i seguenti: si avvale di un segnale tessuto intrinseca e può essere eseguita utilizzando standard a due fotoni in vivo iminvecchiamento apparecchiature, consente il monitoraggio continuo in tutto il campo di vista con una risoluzione profondità di circa 50 um. Abbiamo dimostrato che le aree di tessuto cerebrale più lontane dai vasi sanguigni cerebrali corrispondono alle zone vulnerabili spartiacque che sono i primi a diventare funzionalmente ipossica a seguito di una diminuzione dell&#39;apporto di ossigeno vascolare. Questo metodo permette di immagine ossigenazione microregionale corticale e quindi è utile per esaminare il ruolo di rifornimento tessutale inadeguata o limitata di ossigeno nelle malattie neurovascolari e ictus.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Qui noi descriviamo un metodo per visualizzare direttamente ipossia microregionale tissutale nella corteccia topo<em&gt; In vivo</em&gt;. Si basa su simultaneo a due fotoni imaging di nicotinammide adenin dinucleotide (NADH) e la microcircolazione corticale. Questo metodo è utile per l&#39;analisi ad alta risoluzione di rifornimento tessutale ossigeno.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K Views.  University of Rochester Medical Center. Qui noi descriviamo un metodo per visualizzare direttamente ipossia microregionale tissutale nella corteccia topo In vivo. Si basa su simultaneo a due fotoni imaging di nicotinammide adenin dinucleotide (NADH) e la microcircolazione corticale. Questo metodo è utile per l'analisi ad alta risoluzione di rifornimento tessutale ossigeno.

Video: Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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Neuroscienze

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.