Questo metodo di imaging in vivo delle cellule retiniche consente di indagare sulle malattie oftalmologiche e di comprendere le normali funzioni della retina. Questo metodo fornisce un approccio semplice e altamente riproducibile all'imaging in vivo della retina mediante microscopia a due fotoni. Stabilizzare correttamente il mouse è la chiave per ottenere immagini in vivo di qualità.
Esercitati a posizionare il mouse nel supporto della testa e prendi confidenza con la procedura prima di provare ad acquisire immagini. Sedare l'animale secondo il protocollo di utilizzo degli animali approvato. Applicare la soluzione di dilatazione della pupilla e lasciare il mouse al buio per cinque minuti per consentire alle pupille di dilatarsi.
Fissare il perno del condotto uditivo inferiore nella posizione estesa verso l'interno e il perno del condotto uditivo superiore nella posizione ritirata. Ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la barra dell'auricolare non viene inclinata di 60 gradi sotto l'orizzontale. Con il mouse rivolto verso la barra del morso, montare un orecchio sul perno inferiore esteso con il perno inserito nel condotto uditivo.
Dopo aver allentato la vite che fissa il perno del condotto uditivo superiore, estendere il perno nell'altro condotto uditivo e stringere nuovamente la vite per fissare la testa. Assicurarsi che il mouse sia saldamente nel supporto della testina. Premere verso il basso sulla parte superiore della testa.
Il mouse deve rimanere saldamente nelle barre auricolari e la sua testa deve ruotare liberamente attorno all'asse dei canali uditivi. Con la barra del morso posizionata verso la testa del topo, sollevare delicatamente la testa del topo per consentire agli incisivi mascellari di essere abbassati nel supporto della barra del morso e ritrarre la barra del morso con forza delicata per fissare la testa. Utilizzare la vite per fissare la barra del morso in posizione e posizionare il mouse e il supporto sul palco del microscopio.
Applicare colliri lubrificanti su entrambi gli occhi del mouse. Ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la pupilla di un occhio è orientata in linea con il percorso della luce e posizionare un coprifiltro numero 1,5 nel portafiltro compatto. Dopo aver fissato il supporto allo stadio del microscopio, abbassare il coprislip fino a quando non entra in contatto con il gel per gli occhi lubrificante senza toccare la cornea e regolare lo stadio nella dimensione X-Y e nella posizione Z dell'obiettivo fino a quando la luce di eccitazione a campo largo copre completamente la cornea.
Utilizzare l'oculare per continuare a regolare la posizione Z fino a quando le cellule fluorescenti o le strutture della retina non vengono messe a fuoco, aumentando l'illuminatore di epifluorescenza se necessario per risolvere singole cellule o strutture di interesse. Ottimizzare l'allineamento della retina con il percorso della luce di imaging. Regolare l'angolo della testa fino a quando non si verifica solo l'espansione o la contrazione della luce sfocata quando si cambia il piano focale, riducendo al minimo le distorsioni X-Y.
Quindi, spegnere l'illuminatore a epifluorescenza e chiudere l'otturatore dell'illuminatore. Per l'imaging a due fotoni, seguire tutti i protocolli di sicurezza laser istituzionali. Spegnere e coprire tutta la luce ambientale e passare il percorso della luce di eccitazione al laser e il percorso della luce di emissione ai PMT.
Nel software di acquisizione immagini, impostare la dimensione del fotogramma su 512 per 512 e la media dei fotogrammi su tre. Impostare lo Z-stepping in modo che inizi dalla parte superiore della pila e progredisca verso il basso, riducendo al minimo l'attivazione laser a due fotoni dei fotorecettori. Accendere e abilitare i PMT e regolare la tensione a 680 volt.
Abilita gli otturatori di imaging ed emissione. Inizia un'anteprima dell'immagine dal vivo del tessuto target, a partire da una potenza laser dell'1%, e regola automaticamente la luminosità del display per visualizzare le cellule o le strutture di interesse. Se il tessuto bersaglio è debole o poco chiaro, aumentare la percentuale di potenza del laser fino a quando le strutture diventano visibili senza superare i 45 milliwatt.
Manovra lo stadio del microscopio nella direzione X-Y per centrare l'area di imaging desiderata e naviga verso il piano Z con le strutture di interesse a fuoco. Per un esperimento time-lapse cronico, aprire un'immagine ottenuta in precedenza da utilizzare come riferimento per le celle di interesse, avendo cura che l'angolo di imaging nell'immagine corrente sia simile a quello delle immagini precedenti. Quindi, passare ai piani Z superiore e inferiore di interesse per impostare i limiti Z dello stack di immagini e acquisire l'immagine.
Quando tutte le immagini sono state acquisite, disattivare i PMT e l'otturatore laser. Passare il percorso della luce di eccitazione all'illuminazione a epifluorescenza e il percorso della luce di emissione all'oculare. Quindi, uscire dal software di acquisizione delle immagini, spegnere il laser nell'interfaccia del computer e spegnere l'hardware in ordine di avvio inverso, ad eccezione dell'apparecchiatura sempre attiva.
Al termine dell'analisi, rimuovere il mouse dal supporto della testa e utilizzare un fazzoletto privo di lanugine per rimuovere delicatamente il gel per gli occhi. Quindi, applicare un unguento oculare lubrificante su entrambi gli occhi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a circolazione di acqua calda a 37 gradi Celsius con monitoraggio fino a completa recumbency, prima di riportare il mouse nel suo alloggiamento. Nei topi VGlut-2-Cre, i somi delle cellule gangliari retiniche sono chiaramente distinguibili e i fasci assoni sono spesso evidenti.
La traiettoria degli assoni e l'immagine negativa della vascolarizzazione facilitano l'identificazione della testa del nervo ottico nei topi VGlut-2-Cre, che è utile come punto di riferimento negli esperimenti di imaging cronico. In contrasto con le cellule gangliari retiniche, i neuriti delle cellule amacrine sono più spesso osservati negli strati plessiformi interni. Un giorno dopo l'iniezione intraoculare di NMDA, la microglia retinica mostra processi brevi o morfologia ameboide in conformità con i rapporti precedenti.
La somministrazione del colorante blu di Evans tramite una singola iniezione intraperitoneale da 30 a 60 minuti prima dell'imaging induce una forte etichettatura dei vasi sanguigni emanati dalla testa del nervo ottico che persiste per almeno sette giorni. Dopo la fissazione, la vera distanza tra le coppie di cellule all'interno di interi supporti retinici appiattiti può essere misurata in scansioni confocali e abbinata alle distanze dei pixel in vivo per determinare la dimensione media dei pixel delle immagini in vivo. Le microsfere fluorescenti iniettate negli occhi dei topi consentono la misurazione del diametro della microsfera in vivo, fornendo una stima delle dimensioni dei pixel leggermente più grande ma con una maggiore varianza.
L'imaging in vivo può essere abbinato ad analisi istologiche come l'immunocolorazione e l'ibridazione in situ. Questi metodi possono identificare specifici tipi di cellule ed esaminare l'espressione genica delle cellule visualizzate.
