Gli autori desiderano ringraziare L. Belluscio per le apparecchiature per la chirurgia riprese, D. Kwon per le riprese di assistenza, K. Liu per il video editing di assistenza, e K. MacLeod per tutta la musica di sottofondo. KW riconosce il generoso sostegno della Divisione NIMH dei programmi di ricerca intramurale e le Geni, Cognizione e Programma psicosi. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale NIMH (VC, YY, SMKW) e la Divisione di NIAAA Intramural programma di ricerca clinica e biologica (VC, RMC, DML).

Le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal National Institute of Mental Cura la salute degli animali e del Comitato uso ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura ed uso di animali da laboratorio. 1. Preparazione pre-operatoria <ol><li> Pulire tutti gli strumenti in autoclave a caldo tallone prima dell&#39;intervento chirurgico asettico, pulire il sito chirurgico con il 70% di etanolo, e mettere giù teli puliti. Indossare guanti sterili. Anestetizzare l&#39;animale con una soluzione preparata 1,2% avertin, dato a 0,02 ml / g, intraperitonially. In alternativa, anestetizzare con gas isoflurano attraverso un cono, 5% per induzione, 1,5% per la manutenzione, con un circuito passivo scavenger. Controllare il livello di anestesia con pizzichi di coda o del piede per garantire la sedazione completa. </li><li> Coprire gli occhi dell&#39;animale con pomata oftalmica sterile, e iniettare desametasone preparata (0,2 mg / kg) e carprofen (5 mg / kg) subcutaneously per prevenire il gonfiore e l&#39;infiammazione cerebrale 11. Radersi i capelli sul cranio tra le orecchie, e sterilizzare la pelle con scrub betadine e tre tamponi alternati di etanolo al 70%. </li><li> Montare l&#39;animale in una fase chirurgica stereotassico con earbars, con un cuscinetto riscaldante circolazione dell&#39;acqua sotto il set animale a 37 ° C. Controllare regolarmente i livelli di anestesia dell&#39;animale, e completare la dose di anestetico originale, se necessario. </li><li> Iniettare 200 ml di 0,5% Marcaine sotto la pelle del cuoio capelluto per intorpidire la zona. Incidere la pelle e rimuovere il lembo cutaneo sul cranio. Rimuovere il periostio e asciugare la zona con tamponi di cotone pulito. </li></ol> 2. Cronica Chirurgia Finestra cranico <ol><li> Utilizzare un trapano ad alta velocità dentale con un diametro fresa da 0,5 a delineare delicatamente un cerchio del diametro di 3-5 mm sopra la regione del cervello di interesse. Periodicamente bagnare il sito di perforazione con polvere sterile salina allo 0,9% delle ossa e chiaro via con tamponi di cotone pulito. Se le ossa sanguina, utilizzare gelfoam ammollo con soluzione salina sterile per cancellare al vivo e aspettare che si fermi. </li><li> Quando lo strato ultimo osso è raggiunto, sollevare e rimuovere l&#39;isola osso con punta fine pinze. Dura allegati al ripiano inferiore dell&#39;osso può essere rilevato se la finestra attraversa una sutura ossea. Questi dovrebbero essere delicatamente rimosso come il lembo osseo viene sollevato. </li><li> Rotolo inumidito schiuma gel delicatamente sopra dura esposta per pulire la superficie ed attendere per qualsiasi sanguinamento durale per fermare passaggio critico:. Non procedere fino a quando tutto il sanguinamento si è fermato durale. Sangue che resta intrappolato all&#39;interno della finestra del cranio di solito porta ad una finestra opaca. </li><li> Se la regione di interesse è in una posizione in cui la durata è particolarmente spesso, rimuovendo la dura sopra può essere necessario. Se questo è il caso, separare delicatamente la dura dalla pia sotto con pinze molto fini, una piccola incisione nella sollevato dura con un altro paio di pinze sottili, quindi afferrare i bordi di taglio e delicatamentedividere la dura madre. La dura madre è sottile ma resistente, quindi fate attenzione a non tagliare il cervello con i bordi intatti della dura. </li><li> Sciacquare la zona con ACSF sterile o soluzione fisiologica sterile. </li><li> Posare un vetrino sterile di vetro (3-5 mm) sulla durata o pia passaggio critico:. Se le curve cranio circostanti in modo significativo, utilizzare Kwiksil 12 adesivo per riempire spazi in cui la dura madre e pia non avrebbe stretto contatto con il coprioggetto in regioni che non sarà ripreso. </li><li> Utilizzare gel cianoacrilato a coprire l&#39;adesivo elastomero e bordi del vetrino coprioggetto. Coprire l&#39;intero teschio esposto con cianoacrilato gel, o una miscela di cemento e krazyglue dentale passaggio critico:. Non lasciare che il gel di cianoacrilato a toccare la superficie del cervello. </li><li> Incorporare una misura testa barra metallica di fissaggio dalla parte opposta del cranio. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso una camera di recupero calda, dopo un&#39;iniezione intraperitonial di ketoprofene, 5 mg / kg, for gestione del dolore. Continua l&#39;analgesico per altri due giorni dopo l&#39;intervento. </li><li> Dopo due settimane di recupero post-operatorio, anestetizzare l&#39;animale con isoflurano (5% per l&#39;induzione, 1,5% per la manutenzione), montarlo in una misura palco microscopio con una testa di fissaggio telaio, e controllare la finestra del cranio per chiarezza ottica con l&#39;illuminazione con luce blu. Superficie dei vasi sanguigni del cervello chiarezza è altamente indicativo di qualità finestra cranica. Se i bordi dei vasi sanguigni sono nettamente definita, la finestra può essere utilizzabile. Le due settimane di post-operatorio i tempi di recupero si consiglia di disporre del tempo sufficiente per consentire all&#39;animale di riprendersi da un intervento chirurgico. Finestre craniche tipicamente chiaro e migliorare in questo periodo, e restano otticamente trasparente per settimane supplementari per mesi fino a quando la ricrescita del cranio o ispessimento della dura degrada la qualità finestra. </li></ol> 3. Protocollo di comportamento e di scansione laser a due fotoni Microscopia <ol><li> Gli animali con chiara cfinestre ranial saranno esposti ad uno stimolo ambientale o sottoposto ad una sessione di formazione comportamentale, e poi successivamente ripreso al momento del massimo Arc-GFP espressione. Prima di iniziare un protocollo comportamentale, l&#39;animale deve essere conservato in un ambiente coerente gabbia di casa per ridurre al minimo giorno per giorno variazione della linea di base Arc-GFP livelli di espressione. </li><li> Iniziare la formazione comportamentale o paradigmi stimolazione ambientale, a seconda della regione del cervello di interesse. Per esempio, gli animali possono essere esposti a diversi ambienti visivi per più giorni consecutivi, e ripreso ogni giorno dopo la stimolazione visiva per identificare stimoli-risposte specifiche nella corteccia visiva 10. </li><li> Arc-GFP fluorescenza nei neuroni in genere raggiunge il suo livello massimo due ore dopo la stimolazione. La timeline sperimentale può essere ottimizzato per facilitare l&#39;individuazione di Arc-GFP espressione nei neuroni al loro livello di picco di fluorescenza. </li><li> Dopo una sessione di formazione comportamentale o environmentastimolazione l è completata, anestetizzare l&#39;animale con isoflurano (5% per l&#39;induzione, 1,5% per la manutenzione) e montare l&#39;animale nella misura palco microscopio con testa di fissaggio telaio sotto il microscopio a due fotoni. </li><li> Posizione della testa dell&#39;animale è fissato alla testa di fissazione cornice che si collega direttamente alla fase, utilizzando la barra di metallo impiantato sul cranio. Isoflurano e ossigeno vengono continuamente fornita al mouse tramite un cono. La temperatura corporea è mantenuta utilizzando una piastra elettrica. </li><li> Assicurarsi che i rivelatori microscopio sono protetti dalla luce ambientale, conducendo a due fotoni di scansione laser in una stanza buia. Utilizzare un 20x o 25x (1,05 apertura numerica) obiettivo a immersione in acqua per l&#39;imaging. Primo, sotto epi-fluorescenza illuminazione, acquisire un&#39;immagine di modelli di superficie del vaso sanguigno oltre la regione del cervello di interesse con una camera CCD per allineamento dell&#39;immagine futuro. </li><li> Inizia a due fotoni di scansione laser per acquisire un 3-D serie di immagini. Una Olympus FV1000MPE multi-fotone microscopio è usato nel nostro setup. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione dei due fotoni laser è fissata a 920 nm, e la potenza del laser emesso dall&#39;obiettivo è fissato a circa 50 mW. Fluorescenza emessa viene rilevata contemporaneamente nei canali verde e rosso (specchio dicroico a 570 nm, filtro barriera a 495-540 nm e 570-625 nm), utilizzando un esterno a due canali sistema di rilevazione photomutiplier posizionato vicino al campione. Arc-GFP fluorescenza appare solo nel canale verde, mentre i tessuti auto-fluorescenza appare in entrambi i canali 13, 14. </li><li> Stack di immagini tipiche hanno dimensioni di circa 320x320x100 micron (larghezza x lunghezza x profondità), una risoluzione orizzontale di 0,5 micron / pixel e una risoluzione verticale di 3 micron / pixel. </li><li> Dopo aver acquisito la pila di immagini, rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia casa. Non disturbare l&#39;animale fino alla prossima sessione di imaging e comportamentali. Ripetere la procedura di comportamento e di imaging in giorni come auspicabileed. Utilizzare il precedentemente acquisito superficie del cervello immagine dei vasi sanguigni per orientare nuovamente nella posizione di imaging stessa. </li></ol>

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	<li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity.">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li><li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system.">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li><li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression.">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li><li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity.">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li><li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+growth+factor+and+activity-regulated+gene,+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites.">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li><li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity.">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li><li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+Arc,+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity.">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain.">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li><li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist:+a+review+journal+bringing+neurobiology.">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li><li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey.">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo in vivo immagini qui descritto consente l&#39;esame ripetuto di cambiamenti genetici Arc espressione negli stessi gruppi di neuroni più di più giorni in animale vivo. Si tratta di un metodo efficace e versatile per ottenere informazioni sulla dinamica molecolare plasticità neurali legate a singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali. Standard metodi istochimici come ibridazione in situ e colorazione può realizzare singola cella di risoluzione 3, ma manca la c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotone microscopio a scansione laser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Stereotaxis fase chirurgica per i topi </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> 20X o 25X obiettivo immersione in acqua </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Fase Microscopio con testa di fissaggio telaio </td><td> Una soluzione su misura </td><td> N / A </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Una pinza sottile </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11251-20 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Dental trapano fresa </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 19007-05 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 bit </td><td> Imaging </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

La capacità del cervello di cambiare in risposta alle esperienze è essenziale per la funzione cerebrale sano, e anomalie in questo processo contribuiscono a una varietà di disturbi cerebrali 1,2. Per meglio comprendere i meccanismi con cui i circuiti cerebrali reagiscono all&#39;esperienza di un animale richiede la capacità di monitorare i cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti in un dato insieme di neuroni, per un periodo di tempo prolungato, nell&#39;animale vivo. Mentre l&#39;esperienza e le relative attività neurale è noto per innescare cambiamenti di espressione genica nei neuroni 1,2, la maggior parte dei metodi per rilevare i cambiamenti e non consentono l&#39;osservazione ripetuta dei neuroni stessi più di più giorni o non hanno una risoluzione sufficiente per osservare i singoli neuroni 3 , 4. Qui, descriviamo un metodo che combina in due fotoni microscopia in vivo con un giornalista geneticamente codificato fluorescente per monitorare l&#39;esperienza-dipendenti cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni corticali sul<html> corso del giorno per giorno l&#39;esperienza. Uno dei consolidata esperienza-dipendenti geni è regolata attività proteine ​​del citoscheletro associato (Arc) 5,6. La trascrizione d&#39;Arco è rapidamente e altamente indotta da attività neuronale intensificata 3, e il suo prodotto proteico regola l&#39;endocitosi dei recettori del glutammato e lungo termine plasticità sinaptica 7. L&#39;espressione di Arc è stato ampiamente utilizzato come marcatore molecolare per mappare circuiti neuronali coinvolti in comportamenti specifici 3. Nella maggior parte di questi studi, espressione Arc stata rilevata mediante ibridazione in situ o immunoistochimica in sezioni di cervello fisse. Benché questi metodi ha rivelato che l&#39;espressione di Arc è stato localizzato a un sottoinsieme di neuroni eccitatori, dopo l&#39;esperienza del comportamento, come i modelli cellulari di espressione Arc potrebbe cambiare con episodi multipli di esperienze ripetute o distintivo più giorni non è stato studiato. S copi &quot;&gt; In vivo a due fotoni microscopia offre un modo efficace per esaminare i cambiamenti cellulari esperienza-dipendenti nel cervello vivente 8,9. Per consentire l&#39;esame di espressione Arc nei neuroni vivi da microscopia a due fotoni, abbiamo precedentemente generato un knock- in linea di topi in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno Arc 10. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per tracciamento esperienza-dipendenti Arc-GFP espressione modelli in formazioni neuronali nel animale vivo. In questo metodo , croniche finestre del cranio sono stati impiantati in Arc-GFP topi sulle regioni corticali di interesse. Tali animali sono stati quindi più volte ripreso da microscopia a due fotoni dopo desiderati paradigmi comportamentali nel corso di diversi giorni. Questo metodo può essere generalmente applicabili agli animali che trasportano altri reporter fluorescenti di cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti 4.

<html> Questo protocollo descrive un metodo per tenere traccia delle modifiche molecolari esperienza-dipendenti nei singoli neuroni corticali di animali vivi. Una finestra cronica craniale viene creato su una regione corticale di interesse in un topo che porta un reporter fluorescente dell&#39;espressione genica. Due-fotone microscopia può essere accoppiato con diversi paradigmi comportamentali da osservare comportamentale indotti cambiamenti molecolari in singoli neuroni e tenere traccia delle modifiche negli stessi gr...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Un<em&gt; In vivo</em&gt; A due fotoni metodo di imaging è descritto qui che permette il tracciamento di tali alterazioni molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso giornalisti geneticamente codificati.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K Views.  National Institute of Mental Health. Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Un In vivo A due fotoni metodo di imaging è descritto qui che permette il tracciamento di tali alterazioni molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso giornalisti geneticamente codificati.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...