Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di Ricerca intramurale presso il National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione. Ulteriore supporto è stato fornito da dell&#39;NIDCD 5R01 DC007613.

1. Otricolo Dissection e Cultura <ol><li> Eutanasia di un adulto (4 settimane di età) del mouse utilizzando un protocollo approvato e decapitare. </li><li> Snip il canale uditivo esterno su entrambi i lati della testa e tirare la pelle in avanti verso il naso. Dividono in due la testa da dietro in avanti e rimuovere il cervello da entrambi i lati per rivelare il labirinto osseo. </li><li> Tagliare il cranio dalla coclea ossea e trasferire il labirinto osseo (compresa la bolla) ad una cappa coltura tissutale dotato di un microscopio per dissezione (Nota: lavoro Adenovirus deve essere eseguita in una cappa di sicurezza biologica di classe II). </li><li> Nel cappuccio, trasferire ciascuna coclea di un piatto 35 millimetri coltura tissutale sterili contenenti supporti dissezione (M199, Gibco / Invitrogen # 12.350) (Figura 1A). </li><li> Se la bulla uditivo è ancora intatto (è possibile rimuovere il bulla durante la dissezione lordo inserendo il pollice tra la bulla e l&#39;apice dila coclea), utilizzare due pinze (uno # 3 e uno # 5) per rompere la bulla (Figura 1B). </li><li> Identificare i punti di riferimento della preparazione ossea coclea: ossicini apice, base,, ovali e tonde finestre, radice del nervo VIII, canali semicircolari (Figura 1 C, D). </li><li> Posizionare l&#39;orecchio interno nel piatto con il lato mediale rivolto verso l&#39;alto, in modo tale che l&#39;ovale e rotonda finestre e all&#39;apice sono sul fondo del piatto e la radice del nervo VIII è rivolto verso l&#39;alto. Tenere il preparato utilizzando un # 3 pinza nella regione dei canali semicircolari (Figura 1D). </li><li> Usando un bisturi dotato di una lama # 11, tagliare l&#39;apice della coclea appena apicale della radice del nervo (Figura 1D). </li><li> Ruotare il preparato in modo che la porzione di taglio è rivolto verso l&#39;alto. Utilizzare il canale anteriore semicircolare come maniglia per stabilizzare la preparazione (Figura 1E). </li><li> Utilizzando # 5 pinzette, rimuovere la coclea alle modiolus verso il bassoalla base. Nel punto in cui la regione gancio della coclea gira verso il basso, utilizzare una sonda sottile (mezzo di una pinza rotti # 55) per sollevare l&#39;ultimo ripiano ossea della lamina spirale ossea (figura 1F), rivelando la sacculo. Appena sotto il sacculo è la pedana della staffa, che è un importante punto di riferimento. Il otricolo è immediatamente adiacente alla pedana staffa (figura 1G), ed è circondato da osso. Utilizzare la sonda a scheggiare l&#39;osso distanza sufficiente per rivelare circa 1/3 del otricolo. Rimuovere con attenzione il otricolo utilizzando N ° 55 pinze (Figura 1 H). Questa procedura di solito provoca la rimozione del tetto dell&#39;epitelio pigmentato come utricolo è tirato dalla preparazione ossea. Tuttavia, se il otricolo viene rimosso con l&#39;epitelio intatto tetto, il tetto può essere rimosso utilizzando # 55 pinze. </li><li> Otricoli per l&#39;infezione da adenovirus (o esperimenti di imaging dal vivo) deve avere il otoconia rimossa durante la dissezione (prima infezione).In questo caso, utilizzare una siringa luer-lock che viene riempito con mezzi di dissezione e dotata di un piccolo foro dell&#39;ago (di solito 26-28 gauge). Tenere il otricolo sul bordo utilizzando N ° 55 pinze (Figura 1I). Portare la punta dell&#39;ago vicino al otricolo con la smussatura dell&#39;ago verso il basso. Utilizzare un flusso di dissezione media per soffiare via la otoconia (Figura 1J). In alternativa, otoconia possono essere rimosse mediante spazzolatura loro fuori utilizzando uno strumento di ciglia (Ted Pella, Inc. # 113). Otricoli che non vanno a subire l&#39;infezione adenovirale sono normalmente coltivate liberamente fluttuante in piastre di tessuto a 24 pozzetti con l&#39;intatta otoconia (vedi sotto per la rimozione post-fix otoconia, che è più facile). </li><li> Una volta che tutti otricoli sono sezionati, cambiare i media sezionare alla cultura dei media sterile: DMEM F12 (Gibco # 11320) supplementato con 5% di FBS e 50 U / ml di penicillina G (Sigma). </li><li> Otricoli vengono coltivate a 37 ° C e 5% CO 2. Se le culture devono essere maintaINED per più di 48 ore, la metà dei terreni di coltura dovrebbero essere cambiati ogni altro giorno. Le culture possono essere mantenuti per una settimana o più. </li></ol> 2. L&#39;infezione Adenovirus di cellule di supporto Importante: Lavorare con adenovirus richiede livello di biosicurezza 2 (BSL2) procedure e certificazione. Verificare con il responsabile istituzionale biosicurezza di orientamento e formazione sulle procedure di BSL2. <ol><li> Dissect otricoli come sopra in media di dissezione (no siero). Rimuovere otoconia come sopra. </li><li> Quando si è pronti per infettare, trasferire 1 utricolo (cellule ciliate up) in ciascun pozzetto di una Nunc mini-vassoio (Fisher # 12-565-68) con 15 microlitri di siero-free DMEM F12 (questo è importante perché siero può inattivare il virus) . Questo trasferimento è più facile con uno 1,5 mm microcurette (# 10082-15 da Strumenti Scienza Arti). </li><li> Il nostro Ad-GFP è sierotipo 5 con i geni virali E1 ed E3 eliminati e il promotore umano CMV guida del transgene (GFP). Questo virus è stato ottenuto da vettore BioLabs (Philadelphia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Virus archivio sono forniti a titoli di 1,0-4,0 × 10 10 PFU / ml. Aggiungere 0,5-2 microlitri di virus disponibile in ciascun pozzetto contenente un utricolo (Figura 1L). L&#39;importo effettivo utilizzato varia a seconda del titolo virale e il brodo. Noi di solito infettano ogni otricolo con 1,0-4,0 × 10 7 PFU. </li><li> Cultura le otricoli in virus contenenti supporti a 37 ° C / 5% CO 2 per 2 ore. Dopo 2 ore, trasferire i otricoli Torna alla piastra da 24 pozzetti di coltura contenente terreno di coltura con il siero. Culture i otricoli notte a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Otricoli può essere utilizzato il giorno successivo per gli esperimenti di imaging dal vivo, oppure possono essere fissati per immunochimica capelli cella (vedi sotto). Virali transgenici aumenta di espressione nel corso del tempo, quindi se l&#39;espressione del transgene è bassa a 24 ore dopo l&#39;infezione si puòvantaggioso cellule di coltura ulteriori 24 ore nel siero contenenti supporti. Se vedi la tossicità delle cellule dei capelli, ridurre la quantità di virus usato. </li></ol> 3. Fissazione utricolo, rimozione otoconia e immunochimica <ol><li> Al termine del periodo di coltura, otricoli fissare in paraformaldeide al 4% sia per 3 ore a temperatura ambiente (su una piattaforma oscillante) o per una notte a 4 ° C. Otricoli lavaggio (3 volte, a 15 minuti cadauna) a 0,1 M (1X) pH Sorensen tampone fosfato 7,4. Questi passaggi sono eseguiti in una piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale. </li><li> Rimozione otoconia: Nota: otoconia deve essere rimossa prima dell&#39;infezione adenovirus (vedere il passaggio sopra 1,11). Tuttavia, otricoli che non devono essere infetti possono essere coltivate e fissato con la otoconia ancora intatta. In questo caso, utilizzare i passaggi descritti qui per rimuovere il otoconia dopo la fissazione. Controllare otricoli per qualsiasi epitelio pigmentato rimanenti tetto. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo epitelio tetto con due f # 55orceps. Per rimuovere il otoconia, sostituire tampone fosfato Sorensen con 750-1000 microlitri Cal-Ex decalcificatore (Fisher # CS510-1D). Lascia Cal-Ex su otricoli per 1 minuto e 40 secondi (non superare i 2 minuti). Sostituire Cal-Ex con 0,1 M tampone fosfato di Sorensen e di lavaggio (5 volte, 5 minuti ciascuno). </li><li> Incubare otricoli di boroidruro di sodio (Sigma # 452882, 1% in acqua deionizzata) per 10 minuti. Lavare otricoli in 0.1 M tampone fosfato di Sorensen (5 volte, 5 minuti ciascuno). </li><li> Otricoli di luogo in Blocking Solution (PBS + 2% albumina di siero bovino + 0,8% siero di capra normale + 0,4% Triton X-100) per 3 ore a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li><li> Aggiungere anticorpi primari e incubare durante la notte a 4 ° C. Anti-miosina 7a (o Proteus Biosciences # o # 25-6790 MYO7A 138-1 dal Developmental Studies Ibridoma Bank) a 1:100 nel bloccare le etichette soluzione tutte le cellule dei capelli. Per etichettare separatamente le cellule ciliate striolar e non striolar, abbiamo usato un doppio-label protocol con un anticorpo monoclonale anti-calmodulina (Sigma C # 3545, 1:150) e policlonali anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Anticorpi secondari (di solito Alexa Fluor anticorpi coniugati secondari di Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) sono diluiti 1:500 in soluzione bloccante e incubate per 4 ore al buio a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li><li> Otricoli Mount su vetrini utilizzando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Otricoli coltivate utilizzando questo metodo mantenere pieno complemento di entrambe le cellule dei capelli e le cellule di supporto (Figura 2). Cellule ciliate nelle culture sani mostrano profili tondi nucleari circondate da sottili regioni citoplasmatici che sono miosina 7a-positivo (Figura 2, pannello superiore). Cellule di sostegno (con etichetta anti-Sox2) sono più piccoli e più densamente di cellule ciliate (Figura 2, pannello inferiore). Adenovirus infetta il 25-50% delle cellule di supporto nella utricolo, e non sono infettate cellule ciliate (Figura 2, Ad-GFP pannelli). Va osservato che il titolo di lavoro ottimale di ciascun adenovirus deve essere determinato empiricamente, poiché la morte delle cellule capelli è possibile se il titolo virale è troppo elevato. Inoltre, le regioni di danni meccanici (causati durante la dissezione) avrà grandi quantità di virus. Queste regioni di danneggiamento meccanico sono facilmente distinguibili da una linea continua di cellule con livelli molto elevati di espressione di GFP e cellule cigliate mancanti. Questo è in contrasto con l&#39;espressione GFP dispersa in cellule di sostegno di una coltura non danneggiato (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Otricolo Dissection. A:. Auditory bulla (AB) B:. La bolla è rotto con due pinze robuste C: Bony coclea (RW = finestra rotonda, S =. arteria stapediale, C = coclea, ST = staffa) D: Una lama di bisturi (SB) viene utilizzato per tagliare l&#39;apice della coclea apicale al nervo craniale VIII (8 ° N) ASC = canale semicircolare anteriore E..: La preparazione viene tenuto fermamente con un # 3 pinza con una forchetta inserito nel canale anteriore semicircolare (ASC) e l&#39;altra sull&#39;osso esterno (frecce). Il labirinto membranoso viene rimossa con pinze F:. Con il labirinto membranoso rimosso, il giro basale della lamina spirale ossea è visibile vicino alla regione gancio. Una sonda sottile viene inserita sotto questa piattaforma ossea per sollevare la piattaforma e rimuoverlo (freccia) G:. Dopo la rimozione del sacculo, utricolo (U) è visibile immediatamente adiacente alla pedana della staffa (SF) H:. Utricolo (U ) viene rimosso utilizzando un pinza # 55 (freccia) SF = pedana staffa I:.. otricolo con otoconia (O) parzialmente rimosso und sensoriali epitelio (SE) sotto visibili J:. otoconia (O) vengono rimossi dal otricolo utilizzando un flusso di supporto fornito da una siringa munita di un 26-gauge. L&#39;ombra dell&#39;ago (S) è visibile nella parte inferiore dell&#39;immagine K:. Otricolo con otoconia rimosso e epitelio sensoriale (SE) visibile L:. Infezione adenovirale: ogni otricolo (U) è collocato in un singolo pozzetto di una mini -tray. Cellule di supporto sono infettate con adenovirus pipettando virus nel pozzo (P = punta della pipetta). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno. Otricoli sono state infettate con espressione di adenovirus di guida di proteina fluorescente verde (Ad-GFP). Vengono mostrati immagini confocali dello strato di cellule capelli e lo strato di cellule di supporto nella stessa area di un dell&#39;utricolo. Cellule ciliate sono etichettate con un anticorpo contro 7a miosina(Magenta). Cellule di sostegno sono etichettate con un anticorpo contro Sox2 (rosso). Mostra la struttura schematica dell&#39;epitelio otricolo sensoriale e le posizioni delle cellule capellute (HC) e cellule di supporto (SC). Posizioni di confocali (ottica) sezioni mostrate in alto (U) e inferiore (L) pannelli sono indicati da linee tratteggiate nella schematica. I pannelli superiori: Nelle immagini confocali adottate a livello dei nuclei delle cellule dei capelli, Ad-GFP segnale appare negli spazi tra le cellule dei capelli e non si sovrappone con la 7a capelli miosina marker delle cellule. Pannelli inferiori: In sezioni confocali a livello dei nuclei di supporto, Ad-GFP segnale colocalizza con il marcatore della cella di supporto Sox-2. Ad-GFP risultati infezione nell&#39;espressione GFP in cellule di sostegno solo, e non cellule ciliate sono infetti. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Infezione adenovirale non provocare la morte delle cellule ciliate o cellule di supporto. Utricles sono stati infettati con Ad-GFP a 4 × 10 8 PFU / ml. Otricoli sono state marcate con anticorpi anti-miosina 7 (marker delle cellule dei capelli) e Sox2 (marker delle cellule di sostegno). Cellule dei capelli e della conta delle cellule di supporto sono stati pari a otricoli di controllo e Ad-GFP otricoli infetti.

<ol>
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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Cellule sensoriali sono suscettibili di morte causata da una varietà di stress, compreso l&#39;invecchiamento, trauma rumore, e l&#39;esposizione a farmaci ototossici, compresi gli aminoglicosidi e l&#39;agente antineoplastico cisplatino. Nei risultati di cellule di mammiferi di morte per capelli in perdita permanente dell&#39;udito e / o disturbi dell&#39;equilibrio. In sistemi modello in vitro sono strumenti fondamentali per gli studi volti a determinare i meccanismi cellulari e molecolari alla base...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medium 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12.350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11.320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine pinza (# 55)</td&gt;<td&gt; Strumenti Scienza Belle</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine pinza (# 5)</td&gt;<td&gt; Strumenti Scienza Belle</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinza (# 3)</td&gt;<td&gt; Strumenti Scienza Belle</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillina G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siero fetale bovino</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-vassoio</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex decalcificatore</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodio boroidruro</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452.882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7 bis (policlonale)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7 bis (monoclonale)</td&gt;<td&gt; Developmental Studies Ibridoma Bank</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmodulina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotecnologie Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabella 1</strong&gt;. Reagenti e strumenti utilizzati nella cultura utricolo e l&#39;infezione da adenovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Nota: Ad-GFP è normalmente fornito da Biolabs vettoriali ad un titolo stock di 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Abbiamo richiesto un&#39;amplificazione personalizzato per fornire il virus stock a un titolo di 1,2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

La perdita dell&#39;udito e disturbi dell&#39;equilibrio sono spesso causati dalla morte delle cellule ciliate mechanosensory, che sono le cellule recettori dell&#39;orecchio interno. Poiché non vi è alcuna linea cellulare che rappresenta in modo soddisfacente le cellule ciliate dei mammiferi, la ricerca sulle cellule dei capelli si basa su colture primarie di organi. Il più caratterizzato modello in vitro di cellule mature per capelli mammifero utilizza colture organo di otricoli da topi adulti (figura 1) 1-6. L&#39;utricolo è un organo vestibolare, e le cellule ciliate del utricolo sono simili nella struttura e funzione delle cellule ciliate dell&#39;organo uditivo, l&#39;organo del Corti. Il mouse gli adulti, utricolo rappresenta un epitelio sensoriale matura per lo studio dei segnali molecolari che regolano la sopravvivenza, l&#39;omeostasi, e la morte di queste cellule. Mammiferi cellule ciliate cocleari sono terminalmente differenziate e non vengono rigenerati quando vengono persi. In non-mamvertebrati del Mali, uditivi o vestibolare morte delle cellule dei capelli è seguita dalla rigenerazione robusto che ripristina le funzioni dell&#39;udito e dell&#39;equilibrio 7, 8. Rigenerazione delle cellule dei capelli è mediata da cellule gliali, come le cellule di supporto, che contattano le superfici basolaterale delle cellule ciliate nell&#39;epitelio sensoriale 9, 10. Cellule di sostegno sono anche importanti mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli e la morte 11. Abbiamo recentemente sviluppato una tecnica per infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura con adenovirus. Utilizzo di adenovirus di tipo 5 (dE1/E3) per fornire un transgene contenente GFP sotto il controllo del promotore CMV, troviamo che adenovirus specificamente e infetta efficacemente le cellule di supporto. Sostenere infezione efficienza della cella è di circa 25-50%, e le cellule dei capelli non sono infettati (figura 2). Importante, troviamo che l&#39;infezione adenovirale di cellule di sostegno non comporta la tossicità per le cellule ciliate o cellule di supporto, come il conteggio delle cellule in Ad-GFP infette otricoli sono equivalenti a quelle non infette otricoli (Figura 3). Così adenovirus-mediata espressione genica in cellule di sostegno di otricoli coltivate fornisce un potente strumento per studiare i ruoli di cellule di sostegno come mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli, la morte e rigenerazione.

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Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Cellule ciliate Mechanosensory sono le cellule recettori dell&#39;orecchio interno. Il più caratterizzato<em&gt; In vitro</emModello di sistema&gt; di mature cellule ciliate mammiferi utilizza colture d&#39;organo di otricoli da topi adulti. Presentiamo la dissezione del otricolo topo adulto, e dimostriamo adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura.

Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.6K Views.  Medical University of South Carolina. Cellule ciliate Mechanosensory sono le cellule recettori dell'orecchio interno. Il più caratterizzato In vitro di mature cellule ciliate mammiferi utilizza colture d'organo di otricoli da topi adulti. Presentiamo la dissezione del otricolo topo adulto, e dimostriamo adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Ricerca

Neuroscienze

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Casting cerebrovascolare del topo adulto per l&#39;imaging 3D e analisi morfologica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Topo adulto DRG Explant e dissociato modelli cellulari per studiare neuroplasticità e risposte agli insulti ambientali, compreso l'infezione virale

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Dissezione crio-sezione della zona subependimale adulta per un'analisi quantitativa accurata e profonda del proteoma

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...