This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e del Comitato uso alla Southern Illinois University School of Medicine. 1. Estrazione di temporali Ossa <ol><li> Identificare ossa temporali nella base del cranio del mouse 13 e raschiare via nervi cranici con pinze modello standard. </li><li> Posizionare forcipe modello standard con la punta della capsula otica e con il pollice della mano opposta stampa verso il basso sul canale semicircolare posteriore per rimuovere la coclea incapsulato. </li><li> Liberare la metà inferiore dell&#39;osso temporale dal cranio manualmente con il pollice e l&#39;indice o utilizzando 10,5 cm forbici sottili. </li></ol> 2. Post-fix temporali Ossa <ol><li> Mettere ossa temporali in 2 ml microprovette contenenti 250-500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) diluito in 10 mM tampone fosfato (PBS) pH 7.4 e incubmangiato a temperatura ambiente per 2-20 ore. NOTA: Non è necessaria l&#39;apertura della calotta apicale o iniezione di PFA nella rotonda o finestra ovale. Consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, microscopia elettronica (EM) di grado PFA che può essere acquistato ad una concentrazione del 16% in flaconcini di vetro. Una volta che una fiala viene aperto e diluito 1: 4 in PBS, facendo una soluzione al 4%, può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane se conservato a 4 ° C (Alcuni anticorpi richiedono breve fissazione e altri possono tollerare O / N (O / N) fissazione). </li></ol> 3. decalcify temporali Ossa <ol><li> Dopo la fissazione, rimuovere PFA con una pipetta e sostituirlo con 120 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), poco più di 2 ml. Assicurati di riempire l&#39;intera 2 ml provetta per evitare bolle d&#39;aria quando il tubo è chiuso. <ol><li> In caso contrario decalcificazione immediatamente, sostituire PFA con PBS 10 mM pH 7.4 e conservare i campioni a 4 ° C NOTA: Dopo la fissazione, ossa temporali possono essere conservati per variabLe quantità di tempo prima di decalcificazione seconda delle antigeni esaminata. </li></ol></li><li> Porre le provette su end-over-end dei rotatori e ruotano a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambiare soluzione EDTA quotidiano con una pipetta. Lunghezza della decalcificazione dipende dall&#39;età del campione e la preferenza del scienziato fare la dissezione. <ol><li> Incubare ossa temporali in EDTA utilizzando le seguenti linee guida per i tempi di incubazione: Per i campioni postnatale giorno (P) 8 a P15: 2-4 ore; Per i campioni di P15 P21: O / N; Per i campioni di P21 P30: 2 O / N; Per i campioni di età superiore a P30: 3 o più O / N. NOTA: i tempi di decalcificazione sono soggetti alle preferenze degli utenti e possono essere estesi a seconda delle necessità. Decalcificazione tempo può essere ridotto cambiando la soluzione di EDTA due volte al giorno, circa 8 ore a parte. Alcuni laboratori aggiungi 1% PFA alla soluzione EDTA quando decalcificazione per più di 3 giorni di tempo per evitare la contaminazione. </li></ol></li><li> Per determinare se il campione è adeguatamente decalcificata, posizionare ossa temporali ona silicone elastomero rivestito piatto dissezione e premere delicatamente pinze sulla coclea a forma di chiocciola. Se il tessuto è spongey, allora decalcificazione è completa. </li><li> Una volta che la decalcificazione, rimuovere EDTA con una pipetta e aggiungere 500 ml di -1.000 10 mM PBS pH 7,4. Conservare i campioni a 4 ° C fino al momento di sezionare. </li></ol> 4. Creare silicone elastomero rivestite Dish Dissection <ol><li> Unire la base e il catalizzatore di un kit incapsulante elastomero siliconico in base alle istruzioni del produttore e mescolare accuratamente. </li><li> Aggiungere circa 2-3 cucchiai di polvere di carbone fino a quando la soluzione è di colore nero e mescolare bene. NOTA: l&#39;inchiostro liquido o carbone liquido non si mescolano con la soluzione e non possono essere utilizzati. Kit elastomero incapsulante silicone possono essere acquistati in nero, permettendo passo 4.2 a essere omesso. </li><li> Versare la soluzione in 60 mm di vetro o scatole Petri in plastica, riempimento sufficiente a rivestire il fondo. Se bubbles sono presenti, sfoglia con l&#39;aria sulla superficie. Lasciate riposare almeno 24 ore a temperatura ambiente per impostare. NOTA: piatti elastomero silicone può essere utilizzato più volte per anni. Tuttavia non utilizzare l&#39;etanolo per la pulizia, in modo da causare il elastomero siliconico di crack. </li></ol> 5. intero monte dissezione della coclea (per P7 e campioni più vecchi) <ol><li> Separare il giro basale da curve medio / apicali <ol><li> Posizionare un osso temporale decalcificata in un piatto dissezione elastomero siliconico rivestite riempita per due terzi con 10 mM PBS pH 7.4 e utilizzare un microscopio dissezione stereo per i seguenti passaggi. </li><li> Tenere l&#39;osso temporale nella regione vestibolare con # 4 o # 5 pinze gioiellerie dritto e con 5 mm di forbici a molla Vannas-Tubinga, tagliare l&#39;eccesso di tessuto capsula otica lungo i lati e sopra l&#39;apice. </li><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nella finestra ovale e fare diversi piccoli tagli lungo la spirale legamento / lateraleparete del giro basale. </li><li> Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tubinga, inserire una lama nella regione appena tagliato e posizionare l&#39;altra lama sulla parte esterna dell&#39;osso temporale, mediale alla finestra ovale. Questo taglio separa il giro basale da curve medio e apicale. </li></ol></li><li> Dissezione completa del giro basale. <ol><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici primavera, tagliare le fibre nervose spirale gangliari che si connettono al modiolus per allentare la tensione nel giro basale e tagliare sotto il giro basale a separarsi da organi vestibolari. </li><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, effettuare una serie di piccoli tagli per rimuovere il / parete laterale spirale legamento da sopra e sotto l&#39;organo di Corti. Utilizzare # 4 o # 5 pinze gioielliere dritto per guidare il tessuto. Pin le fibre nervose spirale gangliari al rivestito-elastomero piatto dissezione di silicone, ma non tenere su questa regione come il tessuto si strappa. </li><li> Durante le fasi precedenti, alcuni dei Membran di Reissnere sarà spesso rimosso. Se qualcuno rimane ancora, afferrare la membrana della Reissner con una pinza # 4 o # 5 gioiellerie dritto e tirare via dal organo del Corti. NOTA: La membrana tectorial è raramente visibile e in genere galleggia via senza la necessità di una fase specifica per la rimozione. </li><li> Infine fare diversi tagli per ridurre lo spessore degli assoni spirale gangliari, per far girare il più piatto possibile e utilizzare # 4 o 5 # pinze gioielliere dritto per trasferire il giro basale sezionato, afferrando le rimanenti assoni del ganglio a spirale, a una piastra 48 pozzetti (o una diapositiva da camera) contenente ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4. </li></ol></li><li> Mezzo separata e curve apicali <ol><li> Posizionare i restanti due terzi della coclea, parte apicale verso il basso. </li><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nei media Scala, dove il turno di mezzo utilizzato per essere collegato al giro basale, e fare diversi piccoli tagli lungo il / parete laterale spirale legamento di the turno centrale. </li><li> Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tübingen, inserire una lama nella regione appena tagliato con il blocco di supporto centrale posto sulla parte superiore della lama, e posizionare l&#39;altra lama sul lato esterno del labirinto osseo, a un angolo di punta apicale 90 o. Questo separa la svolta mezzo dalla svolta apicale. </li></ol></li><li> Dissezione completa del blocco di supporto centrale in modo simile al giro basale (vedi i punti 5.2.2 a 5.2.4). </li><li> Dissezione completa del turno apicale. <ol><li> Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, aprire il tappo che copre il turno apicale. Dissezione completa in un modo simile al giro basale (vedere i passi 5.2.2 a 5.2.4). NOTA: dissecato giri cocleari possono essere memorizzati in 10 mM PBS pH 7,4 in una piastra a 48 pozzetti (o camera di scorrimento) a 4 ° C per diverse settimane prima immunocolorazione. Tuttavia PBS evapora e deve essere rifornito periodicamente e stoccaggio più di 2 - 3 settimane può provocare la crescita batterica o fungina sultessuto che può diminuire la qualità dell&#39;immagine. Si consiglia di conservazione a lungo termine di campioni come ossa temporali undissected. </li></ol></li></ol> 6. Immunostaining con fluorescenza Tagged Anticorpi <ol><li> Dopo la dissezione, memorizzare ogni turno cocleare in un pozzo separata in una piastra da 48 pozzetti (o una diapositiva da camera), immerso in ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4. Per ciascuna delle seguenti fasi del turno cocleare deve essere immerso in un liquido, non galleggia sulla parte superiore o attaccato al lato del bene. NOTA: Quando si rimuove liquido da ciascun pozzetto, è facile perdere i giri cocleari o aspirare nella punta della pipetta. Modifica soluzioni con una punta della pipetta 200 microlitri utilizzando un ambito dissezione aiuterà a prevenire questo. </li><li> Usando una pipetta, rimuovere PBS da ogni pozzetto e sostituirlo con ~ 200-300 ml per pozzetto di bloccare / soluzione permeabilizzazione (1% Triton X-100, 1% di albumina sierica bovina (BSA), e siero di capra normale il 10% (NGS) diluito in 10 PBS mm PH 7.4). Incubare 1 ora a RT su un rotatore 3D. NOTA: Se un anticorpo primario utilizzato è stato fatto in una serie di capra, quindi sarà necessario un anticorpo anti-capra secondario e NGS NON deve essere utilizzato per uno dei passaggi. Siero di cavallo normale può essere utilizzato in sostituzione di NGS. </li><li> Rimuovere soluzione bloccante / permeabilizzazione con una pipetta e sostituirlo con ~ 100 microlitri per pozzetto di soluzione di anticorpo primario (0,1% Triton X-100, 1% BSA e 5% NGS diluito in PBS 10 mM pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni anticorpo primario varia. Incubare O / N (minimo 14 ore) a 4 ° C su un rotatore 3D. NOTA: Se si usa più di un anticorpo primario, tutti possono essere combinati nella stessa soluzione per l&#39;incubazione, basta assicurarsi che ogni anticorpo primario ha un host diverso. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Ogni lavaggio incuba un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. </li><li> Rimuovere ultima PBS lavata con una pipetta e sostituire con ~ 100 ml per pozzetto di soluzione di anticorpo secondario (0,1% Triton X-100, 1% BSA, e 5% NGS diluito in 10 mM PBS pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni fluorescente contrassegnati anticorpo secondario è di solito 1: 500 o 1: 1.000. Mettere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggere fluorescente contrassegnati anticorpi secondari dalla luce. Incubare 2-3 ore a temperatura ambiente su un rotatore 3D. NOTA: Se è necessario più di un anticorpo secondario, possono essere combinati nella stessa soluzione per l&#39;incubazione. Assicurarsi che non vi è alcuna possibilità di cross-etichettatura (ad es., Utilizzando capra anti-coniglio e pollo anti-capra anticorpi secondari) </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpo secondario con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. </li><li> Rimuovere ultimo lavaggio PBS utilizzando una pipetta e sostituirlo con ~ 100 pl per pozzetto di HOECHST 33342 (diluito 1: 2.000 in 10 mM PBS pH 7,4) per etichettare nuclei. Incubare 15 - 20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. NON incubare più lungo di 20 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione Hoechst con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. </li><li> Tutte le fasi possono essere estesi, tranne Hoechst incubazione, per diverse ore, se necessario. Per mettere in pausa la reazione in qualsiasi momento, basta immergere campioni in ~ 500 ul di 10mM PBS pH7.4 e conservare la piastra 48 be &#39;(o una diapositiva da camera) a 4 ° C fino al momento di riprendere le ore di protocollo o 1 - 2 giorni dopo . </li></ol> 7. Montare Cochlear Attiva diapositive <ol><li> Etichetta vetrini con informazioni pertinenti sul campione e anticorpi utilizzati. </li><li> Pipettare ~ 50 ml di supporti di montaggio sul ogni diapositiva e stia attentoper evitare bolle. Centrifugare la provetta contenente il supporto di montaggio per rimuovere eventuali bolle. </li><li> Utilizzando # 4 o pinze # 5 del gioielliere dritto, afferrare gli assoni del ganglio spirale di trasferire delicatamente un giro cocleare dalla piastra 48 pozzetti alla diapositiva e posto nei media di montaggio. Montare un giro cocleare per diapositiva per evitare l&#39;esposizione alla luce e photobleaching durante il processo di imaging. </li><li> Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire quel turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d&#39;aria. Se una di queste condizioni, pinza uso # 4 o # 5 del gioielliere dritto per riposizionare il turno cocleare. </li><li> Luogo un&#39;estremità di un coprioggetto sul vetrino e delicatamente rilasciare far cadere coprioggetto. </li><li> Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire che il turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d&#39;aria. Se una di queste condizioni, spostare delicatamente il coprioggetto avanti e indietro per riposizionare il turno cocleare. </li><li> Collocare i vetriniin una cartella diapositiva in modo che essi rimangano piatti. Lasciate montaggio supporti cura O / N a temperatura ambiente (tenere al buio) </li><li> Coprioggetto Seal con smalto trasparente e conservare a temperatura ambiente o -20 ° C fino a creare l&#39;immagine. Le diapositive possono essere memorizzati in una cartella diapositiva o scivolo box. NOTA: Le diapositive possono essere conservati a lungo termine a -20 ° C o -80 ° C e fluorescenza verrà mantenuto per diversi mesi. </li><li> Le diapositive di immagini utilizzando un microscopio confocale con la lunghezza d&#39;onda appropriata sulla base delle anticorpi secondari utilizzati durante la procedura di immunocolorazione. Luminosità e contrasto regolazioni possono essere eseguite utilizzando il software di imaging fornito dal venditore confocale. </li></ol>

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D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells:+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse.">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442 (2011).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth,+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones.">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li><li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs.">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li><li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium.">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li><li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome:+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology.">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Ci sono diversi passaggi critici per il successo dell&#39;intero dissezione mount e immunocolorazione. Tuttavia prima di uno di questi metodi vengono eseguiti, è necessaria un&#39;adeguata fissazione del tessuto cocleare. Si consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, grado EM PFA. PFA ottenuta dalla polvere può avere tracce di metanolo e un pH instabile che diminuisce la qualità di immunofluorescenza. Altri gruppi hanno anche dimostrato che le dissezioni simili sono possibili utilizzando fissativi c...

La coclea a forma di spirale dell&#39;orecchio interno, contenuto all&#39;interno l&#39;osso temporale, ospita l&#39;organo del Corti, l&#39;organo sensoriale uditivo fine nei mammiferi. La coclea è tonotopically organizzato e comunemente suddivisa in apicale, centrale e basale giri corrispondente alle regioni di frequenze diverse con rilevamento del suono ad alta frequenza nella base e il rilevamento a bassa frequenza nel vertice 1. Le cellule cigliate, le cellule meccanosensoriali dell&#39;organo di Corti, eseguire la lunghezza della coclea, della lunghezza di circa 6 mm in topi 2,3. Queste cellule convertono l&#39;energia meccanica delle onde sonore, che sono trasmessi attraverso il labirinto membranoso pieno di liquido, in segnali neurali che vengono elaborati dalle strutture uditive centrali. La tecnica qui descritta fornisce un metodo per preparare supporti interi dell&#39;organo di Corti dopo calcificazione della coclea è completa (per i campioni che vanno da una settimana di vita adulta). Vi presentiamo anche un metodo per immunostavorazio il tutto montato tessuti cocleare. Supporti interi cocleari sono cruciali per la visualizzazione di tutte le cellule dei capelli e circostante cellule di sostegno nei loro arrangiamenti spaziali naturali e consentire l&#39;analisi in tre dimensioni con l&#39;uso della microscopia confocale. Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originariamente descritto un intero metodo di montaggio dissezione cocleare nel 1966. Hanno dettagliato una tecnica per fissare rapidamente e sezionare coclee calcificata immersi in un liquido da una varietà di mammiferi, preservando brevi segmenti intatti dell&#39;organo del Corti per l&#39;analisi microscopica 4. La dissezione di un unfixed, calcificata ratto coclea è stato illustrato in un video didattico 5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding alla Washington University fatto diverse modifiche importanti a questo metodo. Nella loro versione del metodo cocleare tutto il monte, l&#39;osso temporale era decalcificata, incorporato nella plastica, e cinque semi-spire o dieci quarti di giri erano dissezioneted 6,7. Dr. Charles Liberman e colleghi Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye e Ear Infirmary, modificato questa tecnica in modo che embedding plastica non è stato richiesto 8. Ulteriore modifica della tecnica si è verificato nel laboratorio del Dr. Jian Zuo in Ospedale dei Bambini St. Jude 9-12, che ha informato il metodo di dissezione presentato qui. Usiamo una strategia diversa per accedere al dell&#39;organo del Corti di Bohne e Liberman, che permette l&#39;isolamento di apicale completo, medio, e si gira basali. Così il tessuto sezionato è più grande e meno probabilità di essere perso o danneggiato durante i processi di dissezione e di immunoistochimica. Inoltre, l&#39;attuale metodo facilita misura della distanza dalla punta apicale o gancio basale per identificare una regione di frequenza. Anche se molti laboratori svolgono immunocolorazione del tessuto cocleare, non è chiaro in cui questo metodo ha avuto origine. Di conseguenza ci sono varie ricette per il blocco buffers e buffer di incubazione anticorpo che possono influenzare le prestazioni di anticorpi primari individuali. Qui, presentiamo un metodo per immunocolorazione con anticorpi targhette fluorescenza che è applicabile agli anticorpi più comunemente usati nel campo uditivo. La forma complessa della coclea, delicata struttura dell&#39;organo del Corti, e encasement ossuto forniscono una sfida per l&#39;analisi istologica e biochimica. Una varietà di tecniche sono attualmente utilizzati nel campo dell&#39;udito di superare queste caratteristiche difficili e visualizzare le cellule all&#39;interno dell&#39;organo di Corti, ogni tecnica con i suoi vantaggi e svantaggi. Il protocollo presentato qui permette per tutta la dissezione monte della coclea topo adulto e, con leggera modifica, può potenzialmente essere utilizzato per esaminare le strutture critiche all&#39;interno del coclee da una varietà di altri organismi modello utilizzato in campo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:377px;">Standard&#160; pattern forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11000-12</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">10.5 cm fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814</td>
			<td style="width:395px;">TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">end-over-end tube rotator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">activated charcoal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC134372500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereo dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #4 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mm Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td>curved&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-52</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8 well chamber slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1256518</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, fraction V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NHS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D rotator</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>R3D-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot incubation box XL</td>
			<td>Licor</td>
			<td>929-97401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Prolong gold antifade mounting media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coverslips 22 x 22 x 1</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clear nail polish</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cardboard slide folder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Presentiamo un metodo per isolare l&#39;organo del Corti come tre giri intatte cocleari (apice, medio e base) dal tessuto cocleare che è calcificata, con gradini dissezione chiave presentati in Figura 1. Durante la prima settimana postnatale dello sviluppo, calcificazione Mouse coclea è incompleta e più semplice metodo di dissezione 13 può essere utilizzato. Utilizzando l&#39;intero metodo di dissezione monte neonatale con coclea da P7 e anziani topi risul...

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Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Vi presentiamo un metodo per isolare l&#39;organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

54.6K Views.  Southern Illinois University, School of Medicine.  Vi presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea. 

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Ricerca

Neuroscienze

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

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