Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 a AJRB] e un American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] pilota projectaward [a AJRB]. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Vescovo per la lettura critica del manoscritto e commenti sul video e Adam Brown in particolare, per l&#39;esempio di cosa non fare. Ringraziamo il Dr. Donald McEwen del Cancro Greehey per bambini Istituto di Ricerca per averci permesso l&#39;uso della sua portata dissezione / videocamera set-up per le riprese del video dissezione. Ringraziamo Daron Brown Corte strumenti per l&#39;affilatura e la riparazione dei nostri strumenti di microdissezione.

1. Rimuovere il tessuto estranea dalla parte esterna dell&#39;occhio <ol><li> Versare 1X PBS nel coperchio di un piatto da 35 mm. Il livello dovrebbe essere appena sotto il bordo del coperchio. </li><li> Utilizzando pinze dritto, occhio di trasferimento (s) dal tubo di stoccaggio per il piatto da 35 mm. Gli occhi sono immersi in PBS per due motivi: 1. I tessuti estranei si &quot;galleggiare&quot; lontano dagli occhi in modo da poter vedere e rimuovere facilmente, e 2. Durante la dissezione, l&#39;occhio naturalmente mantenere la sua forma sferica, mentre in sospensione, che consente di lavorare con questa forma, piuttosto che contro di essa. </li><li> Utilizzando entrambe le coppie di pinze ad angolo (45 ° e 15 °), rimuovere delicatamente il muscolo e del tessuto connettivo più possibile, tirando il tessuto contro il grano (cioè verso la cornea). Alcuni tessuto connettivo rimarrà. Sforzo dovrebbe essere fatto per spremere il bulbo oculare il meno possibile. </li><li> Commercio tuoi 15 ° per le forbici pinze a molla. Mentre si tiene l&#39;occhio fisso con 45 pinze °, usare le forbici per tagliare via primavera muscolare residua e del tessuto connettivo, così come il nervo ottico. * Suggerimento: utilizzare il bordo esterno delle forbici per spingere il tessuto contro il grano (verso il Corneo-sclerale divisione) e poi tagliare. Continuare fino a tutto il tessuto estraneo è stata rimossa dall&#39;occhio. </li></ol> 2. Togliere la cornea e la lente <ol><li> Con la cornea rivolta verso l&#39;alto, usare il forcipe 45 ° a pizzicare una piega piccola al centro della cornea. </li><li> Utilizzando le forbici primavera, fare una piccola incisione alla base del lembo. Lascia andare il lembo. </li><li> Tenendo gli occhi ancora con il forcipe, inserire la lama inferiore a forbice e in perpendicolare l&#39;incisione ed effettuare un taglio verso il Corneo-sclerale dividere. Cercate di mantenere la vostra lama inferiore sotto l&#39;iride così sia la cornea e iride sono tagliati. Non tagliare fino al Corneo-sclerale dividere. Tenere le forbici inserito negli occhi. </li><li> Utilizzando il forcipe 45 °, con attenzione ruotare l&#39;occhio in modo che le forbici siano parallele al Corneo-sclerale dividere e fare un piccolo taglio. Ruotare lentamente I ° occhio 360, facendo piccole incisioni tutto intorno. Ancora una volta, cercare di mantenere la lama inferiore del forbici primavera sotto l&#39;iride in modo che sia l&#39;iride e la cornea vengono tagliati. Sollevare l&#39;iride e la cornea lontano dal resto dell&#39;occhio e disfarsene. </li><li> Inclinare l&#39;occhio su un lato e premere leggermente sulla metà posteriore dell&#39;occhio, costringendo la lente fuori. Eliminare l&#39;obiettivo. L&#39;interno della conchiglia oculare rimanente è rivestita dalla retina neurale, che dovrebbe apparire liscio e opaco. </li></ol> 3. Quarto l&#39;oculare con conseguente, risultando in un 4 - &quot;petali&quot;, fiore-come la struttura <ol><li> L&#39;occhio deve essere posizionato in modo tale che l&#39;apertura della conchiglia oculare è perpendicolare al vostro corpo. Usa la tua pinza 45 ° posizione stabile e il paraocchi. </li><li> Tenendo le forbici primavera di fronte a voi in modo che siano perpendicolari al vostro corpo, inserire la lama inferiore del forbici molla nel bordo superiore della coppa occhio aperto. Utilizzando il forcipe 45 °, con attenzione allineare l&#39;oculare in modo che un unico taglio dritto può essere fatta dal Corneo-sclerale dividere verso la testa del nervo ottico. Tutti i tagli devono essere perpendicolari alla Corneo-sclerale dividono e se non specificato, dovrebbe andare il più vicino alla testa del nervo ottico possibile senza il taglio in esso. </li><li> Ruotare di 180 ° oculare, mantenendo la sua perpendicolarità con il tuo corpo. Usare la tecnica al punto 3.2 per fare un secondo taglio perpendicolare. </li><li> Ruotare l&#39;oculare e ripetere la tecnica descritta al punto 3.2 per fare due tagli più. Tutti e quattro i tagli dovrebbero essere il più vicino a 90 ° di distanza possibile. Tenete a mente che l&#39;occhio non è perfettamente sferica quindi non ci sarà una certa variabilità. </li></ol> 4. Tagliare ciascuno dei quattro &quot;petali&quot; a metà, con un conseguente otto petali di fiori come la struttura <ol><li> Trasferire il oculare squartato dal piatto 35mm a un vetrino pulito. Con l&#39;oculare rivolto verso l&#39;alto, scoop sotto di essa a pinze a 45 °. Delicatamente sollevare il liquido e metterlo su un vetrino pulito. </li><li> Utilizzando entrambe le coppie di pinze ad angolo, con delicatezza si aprono gli occhi, con la retina neurale verso l&#39;alto. NON RIMUOVERE LA RETINA-NEURALI aiuta l&#39;occhio mantenere alcune delle sue forma sferica in modo che non sta lavorando contro di essa. Inoltre protegge il RPE di essere accidentalmente danneggiato nelle seguenti procedure. </li><li> Ruotare la diapositiva fino a quando uno dei petali è perpendicolare al vostro corpo. </li><li> Usa la tua pinza 15 °, con delicatezza afferrare l&#39;angolo del petalo. L&#39;angolo del petalo dovrebbe essere cornea, non retina neurale o RPE. Sollevare l&#39;angolo dolcemente, permettendo così di mantenere la sua curvatura. </li><li> Inserire la lama inferiore della forbice molla tra il petalo e la diapositiva. Allineare le forbici in modo che un singolo, dritto, perpendicolare taglio può essere fatto dal Corneo-sclerale dividere verso la testa del nervo ottico. Tagliati il ​​più vicino alla testa del nervo ottico come withou possibilet taglio in esso. Lascia andare il petalo, permettendo così di mentire sulla diapositiva. </li><li> Ruotare la diapositiva 90 °, in modo che il petalo successivo è perpendicolare al vostro corpo. Ripetere il punto 4.5. </li><li> Ripetere i passi 4.5 e 4.6 volte di più. La struttura risultante dovrebbe essere simile a un otto petali di fiore. </li></ol> 5. Rimuovere la retina neurale <ol><li> Pipetta 100-200 ml di PBS 1X sul campione. Questo consentirà di evitare la retina neurale di attaccarsi come staccatelo della RPE. </li><li> Di solito la retina neurale è vagamente collegato al RPE. Tuttavia, ci vuole pratica e abilità per rimuovere solo la retina neurale e non l&#39;RPE. Afferrare un petalo della retina neurale con un paio di pinze ad angolo, mentre la stabilizzazione (tenendo premuto) il resto degli occhi con l&#39;altra coppia di pinze ad angolo. Tirare la retina neurale lontano dal resto dell&#39;occhio. Continuare questa procedura fino a quando l&#39;intera retina neurale è stato rimosso. * Suggerimento: bastone la punta delle pinze 15 ° nella testa del nervo ottico per ancorare l&#39;occhio. Quindi utilizzare le pinze 45 ° a spazzare sotto la retina neurale e sollevarlo e via. Di solito è meglio per sollevare la retina neurale dalla testa del nervo ottico verso la Corneo-sclerale dividere. Assicurati di tirare fuori ogni residuo sciolto dell&#39;iride. L&#39;iride è molto appiccicosa e può altrimenti si blocca al RPE. </li><li> Lavare il campione con PBS 1X. Pipetta 100-200 ml di PBS 1X nel campione e succhiare il backup. Gettare la PBS. Ripetere se necessario per rimuovere la polvere e detriti. </li></ol> 6. Mount che si provino (s) su un vetrino <ol><li> Pipettare 80-90 ml di glicerolo al 90% su un vetrino nuovo in una forma rettangolare. Utilizzare la parte del puntale per fare un pari, striscio rettangolare di glicerolo. (Questa è la procedura per il montaggio di due RPE su una diapositiva.) </li><li> Inserire il braccio inferiore di 15 ° sotto forcipe il campione. Sollevare delicatamente il campione dal vetrino dissezione. </li><li> Abbassare lentamente il campione in glicerolo. Muovere delicatamente la pinza come li tira fuori da sotto il provino. </li><li> Ripetere i passaggi 6,1-6,3 per il campione di altri. </li><li> Ruotare la diapositiva in modo che il lato lungo è perpendicolare al vostro corpo. Tenere il vetro di copertura ad un angolo di 45 ° alla diapositiva in modo che tocca la diapositiva. Spostarlo verso il glicerolo striscio fino a quando non toccano. Mantenendo il contatto tra il vetro di copertura e far scorrere, spostare lentamente il vetro coperchio dalla macchia, verso il bordo della diapositiva. Allineare i lati lunghi della diapositiva e il vetro di copertura in modo che siano paralleli. Afferrare gli angoli del vetro di copertura tra il pollice e l&#39;indice. </li><li> Raccogliete i 15 ° in pinza l&#39;altra mano. Culla in alto (gratuito) bordi del vetro di copertura nell&#39;incavo del braccio. Molto lentamente, abbassare il vetro di copertura. Quando avviene il contatto tra il vetro di copertura e il glicerolo, fermarsi e attendere che il glicerolo a migrare. Ripetere questo abbassamento e in attesa fino a quando i monti RPE suo complesso sono completamente coperti. Questo per evitare che il glicerolo altamente viscosi dalla cattura bolle d&#39;aria. NON spingere il vetrino - il glicerolo si spremere fuori da sotto, rendendo l&#39;adesione molto povera. </li><li> Con chiaro smalto, vernice intorno al perimetro in cui il vetro di copertura e far scorrere incontrano. </li><li> Mettere il vetrino in cima di un rack vuoto ad asciugare. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Il risultato di questa procedura dovrebbe essere una struttura che sembra un fiore e dovrebbe essere abbastanza simmetrico. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Tutto RPE montare da un mouse tipo selvatico C67Bl/6J. RPE da nero o agouti animali devono essere di colore bruno scuro e dovrebbe avere una superficie liscia. E &#39;normale notare ondulazioni nella topografia dei petali. La pigmentazione su qualsiasi campione danno può essere un po &#39;variabile, a causa della densità variabile di pigmentazione sia del RPE e la coroide sottostante. Frecce bianche indicano ipopigmentate &quot;canali&quot; - questo è normale ed è dovuto alla vascolarizzazione di fondo dell&#39;occhio. Freccia blu per danni fisici sia per l&#39;EPR e la coroide sottostante. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Tutto RPE montare da un topo diluito. I campioni raccolti da animali diluite può variare di colore dal quasi trasparente al café au lait e qualunque esemplare è come avere variabilità al suo interno, indicato in cerchi neri qui. In generale, RPE raccolti da animali più giovani sono più leggeri e quelli raccolti da animali più vecchi sono più scuri. Frecce nere indicano alcuni dei vasi sottostanti, che appare ipopigmentate. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Falloidina colorazione può essere utilizzato per rilevare i danni fisici al RPE. Colorazione falloidina delinea chiaramente le membrane cellulari, che mostra la forma esagonale dell&#39;epitelio. (A) Esempio di un topo nero. (B) Esempio di un topo diluito. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un RPE poco sezionato da un topo diluito. (A) Le parentesi indicano i margini di cornea che sono troppo larghi, che possono causare deformazioni e / o pieghevoli. All&#39;interno del cerchio nero si possono vedere una quantità eccessiva di tessuto estraneo che non sono stati rimossi dalla parte posteriore dell&#39;occhio. Sono particolarmente evidenti perché il campione è da un animale diluita. Il petalo in basso a sinistra è parzialmente ripiegato. (B) Questa montare tutto ha l&#39;aspetto di una girandola. Frecce nere indicano alcuni dei tagli che sono state fatte. Molti dei tagli dal Corneo-sclerale dividere verso la testa del nervo ottico non sono in linea con il diametro. (C), le frecce nere indicano come i tagli avrebbero dovuto essere effettuati, in linea con il diametro e perpendicolare alla tangente.

<ol>
	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La RPE è il sito delle Nazioni Unite p test, un test in vivo di omologia-diretto di riparazione. Il saggio p ONU è stata usata per studiare gli effetti dei danni del DNA diverso 1,2 e segnalazione danni del DNA e geni di riparazione 3,4,5 sulla frequenza di omologia-diretto di riparazione. Questo test è molto sensibile, rileva cella singola eventi sulla RPE 1. Si può anche rilevare le differenze nei tempi di omologia-diretto eventi di ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

L&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova nella parte posteriore dell&#39;occhio dei mammiferi, appena sotto la retina neurale, che contiene i fotorecettori (coni e bastoncelli). La RPE è un monostrato di cellule pigmentate cuboidali e associa a stretto contatto con la retina neurale sopra di esso. Questa associazione fa la RPE di grande interesse per i ricercatori che studiano le malattie della retina. La RPE è anche il luogo di un test in vivo di omologia-diretto di riparazione del DNA, il test p Nazioni Unite. L&#39;occhio del mouse è particolarmente difficile da analizzare per le sue ridotte dimensioni (circa 3,5 millimetri di diametro) e la sua forma sferica. Questo articolo illustra in dettaglio una procedura per la dissezione degli occhi con conseguente montare tutta la RPE. In questa procedura, si mostra come lavorare con e non contro, la struttura sferica dell&#39;occhio. In breve, il tessuto connettivo, muscolare e del nervo ottico vengono rimossi dalla parte posteriore dell&#39;occhio. Poi, la cornea e la lente sono stati rimossi. Successivamente, tagli strategici sono realizzati che si traducono in appiattimento significativa del tessuto residuo. Infine, la retina neurale è leggermente sollevato, rivelando una RPE intatto, che è ancora collegato al sottostante coroide e sclera. Questo monte intera può essere utilizzato per eseguire il test p Nazioni Unite o per la valutazione immunoistochimica o immunofluorescenza del tessuto RPE.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Una dimostrazione formale della dissezione di un occhio del mouse, per un monte di tutto l&#39;epitelio pigmentato retinico.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K Views.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. Una dimostrazione formale della dissezione di un occhio del mouse, per un monte di tutto l'epitelio pigmentato retinico.

Video: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell&#39;epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Ricerca

Neuroscienze

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Isolamento della retina di topo e trattamento con metanolo per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autore in primo piano: Preparazione a montatura intera a base di metanolo per lo studio delle cellule gangliari retiniche  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...