Questo lavoro è stato finanziato da borse di studio del National Cancer Institute di R01 CA120368, le R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) e K25 CA138578 (FL), e la Canadian Institutes of Research Award borsa Salute post-dottorato (KMT ). Lo sviluppo del sistema di tomografia di fluorescenza è stato parzialmente finanziato da Advanced Research Technologies (Montreal, QC).

1. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare topo nudo (Charles River, Wilmington, MA) con intra-peritoneale iniezione di ketamina xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg ip). </li><li> Luogo del mouse nel frame stereotassico, fare un&#39;incisione nel cuoio capelluto sul lato sinistro del cranio e, utilizzando un ago calibro 18, creare un 1 mm di diametro foro nel cranio, 2 mm dalla linea centrale e 2 mm dietro il bregma. </li><li> Iniettare 5 × 10 5 U251 cellule umane di glioblastoma neuronali (gentilmente fornito dal Dr. Mark Israele a Dartmouth College, Hanover, NH) in 5 ml di soluzione tampone fosfato nell&#39;emisfero cerebrale sinistro ad una profondità di circa 2 mm sotto la superficie del cervello. Utilizzare un micro-siringa Hamilton 18 ed un smussato fine 27-gauge per l&#39;impianto delle cellule ed inserire la punta dell&#39;ago 3 millimetri dalla superficie esterna del cranio e poi ritirarsi 1 mm a creare una tasca per le cellule. </li><li> Suture sito di incisione e consentire recupero da un intervento chirurgico. </li><li> Attendere ~ 14 giorni per permettere al tumore di crescere prima di imaging. </li></ol> 2. Fluorescenza Tomografia sistema di calibrazione <ol><li> Il giorno di imaging mouse, avviare il sistema e consentire laser e sensori di luce per riscaldare per circa 20 minuti per evitare derive della sensibilità del sistema. </li><li> Mettere a 100 °-by-4 ° di ingegneria linea diffusore (Thorlabs, Newton, NJ), al centro diretta del portale imaging, normale al laser di eccitazione: un picosecondo-pulsato 80-MHz multimodale 635 nm diodo laser (PicoQuant Photonics Nord America Inc., Westfield, MA). Regolare l&#39;angolo del diffusore per massimizzare la quantità di segnale rilevata da tutti i canali di raccolta luce cinque. Una descrizione completa della geometria di imaging viene fornito altrove 11,14,15. </li><li> Posizionare OD 2 filtri a densità neutra (Thorlabs, Newton, NJ) davanti a tutti i tubi fotomoltiplicatori fluorescenza di rilevamento (PMT) e OD 1 filtri a densità neutra (Thorlabs, Newton, NJ) di fronte a PMT rilevamento tutti trasmittanza. Raccogliere 100 profili temporali diffusione impulsi (TPSF) del laser, ciascuno con una 1-s tempo di integrazione. </li><li> Normalizzare ogni TPSF dal riferimento laser, corretto per la deriva temporale di riferimento laser, e la media di tutte le iterazioni per ogni rivelatore. Questi sono i medi TPSFs rilevatore specifiche funzioni di risposta dello strumento (IRF) utilizzati nella ricostruzione dell&#39;immagine ottica. </li></ol> 3. Imaging Protocol <ol><li> Anestetizzare la topo con 2% di isoflurano ossigeno (1 L / min). </li><li> Iniettare 1 nanomole di IRDye 800CW-EGF e 1 nanomole di Alexa Fluor 647 in 100 ml di soluzione tampone fosfato, per via intraperitoneale, 12 ore prima di imaging per indirizzare la crescita epidermico fattore di sovraespressione del recettore nel tumore. </li><li> Posizionare il mouse sulle vetroresina supporta del letto imaging, disponendo il mouse in modo che il suo naso rimane in un cono di fornire l&#39;anestesia isoflurano. </li><li> EnAssicurarsi che il mouse viene posizionato opportunamente sul letto: cioè, che quando il letto è fissato nel sistema tomografia fluorescenza il mouse è al centro approssimativo del cavalletto di imaging. Tale posizionamento può essere guidata ruotando il laser di eccitazione 180 ° sul mouse, assicurando che il punto focale del laser illumina un punto approssimativamente al centro del mouse dal punto di vista del laser a tutti gli angoli. </li><li> Una volta posizionato, trasferire accuratamente il letto di imaging e il mouse per il microCT (eXplore Locus, GE Healthcare, London, ON) scanner e raccogliere informazioni anatomiche con una risoluzione di 93 micron isotropo per la testa tutto il mouse. </li><li> Visualizzare la serie di immagini CT e scegliere la fetta (s) di essere ripreso con il sistema di tomografia fluorescenza. </li><li> Trasferire accuratamente il letto di imaging e il mouse al sistema tomografia di fluorescenza. Scegli il numero di posizioni di origine per raccogliere i dati relativi il mouse per ogni SLIC di imaginge (32), il tempo di integrazione per ogni misurazione TPSF (1 s), il numero di iterazioni per ogni posizione della sorgente (10), e la posizione e il numero di fette di imaging desiderati dalla serie di immagini CT dal punto 3,6. I numeri tra parentesi sono valori tipici per ciascun parametro di imaging cedere ~ 5 minuti di acquisizione dati per fetta imaging. </li><li> Mettere filtri notch triple (Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT) di fronte ai PMT rivelazione a fluorescenza, a limitare ogni luce laser di raggiungere i rivelatori di fluorescenza, e OD 2 filtri a densità neutra di fronte PMT di rilevazione della trasmittanza per evitare la saturazione di tali rivelatori. </li><li> Eseguire il software di acquisizione dati, raccogliendo fluorescenza e TPSFs trasmittanza in ciascuna posizione determinata sorgente rivelatore e per ogni lunghezza d&#39;onda di eccitazione (635 nm e 755 nm per eccitare il Alexa 647 e IRDye 800CW-EGF traccianti, rispettivamente). Per ogni serie di TPSFs collezionati, monitorare e registrare l&#39;intensità del lasercon un canale di riferimento PMT. </li></ol> 4. Ricostruzione di immagini <ol><li> Determinare la superficie esterna del mouse e la posizione delle aste di supporto di imaging letto dalle immagini CT e creare maschere che copre i confini del mouse e le aste di imaging separatamente. </li><li> Utilizzare la maschera mouse per produrre un mesh ad elementi finiti dell&#39;animale utilizzando il software NIRFAST 19. </li><li> Localizzare le posizioni della sorgente e del rivelatore dal sistema tomografia fluorescenza sulla superficie della rete basata su fluorescenza e microCT registrazione coordinate spaziali 20. </li><li> Rimuovere ottici punti di dati associati con posizioni di origine o rivelatore che interagiscono con la posizione delle aste di imaging letto di supporto. </li><li> Normalizzare i dati raccolti in ciascuna posizione del rivelatore di origine dal riferimento laser, corrette per la deriva temporale di riferimento laser, e corretto per sensibilità del filtro, che sono stati determinati per via sperimentale<html> al momento dell&#39;acquisto 15. </li><li> Prendere il Rapporto Nato dei dati (fluorescenza diviso trasmittanza) per ciascuna sorgente-rivelatore di posizione e si moltiplicano con un modello di simulazione in avanti di trasmittanza in base alla mesh ad elementi finiti animale uniformi proprietà ottiche. Questo viene fatto per ridurre gli errori associati alla accoppiamento sorgente o rilevatore-tessuto 21, per calibrare i dati al modello 22, e per regolare i dati per altri aspetti del modello-dati corrispondenza 23,24. </li><li> Costruire un vettore di dati composto della differenza scala dei dati raccolti rapporto nati ad entrambe le lunghezze d&#39;onda. Il fattore di scala è stato scelto per ottimizzare il contrasto vincolante EGFR. Eseguire dominio del tempo ricostruzione delle immagini con i dati di differenza calibrato utilizzando il TPSF per ciascun canale di rilevamento come input, e creare mappe fluorescenza del mdc mirata tracciante 15. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi &quot;&gt; Un esempio di una ricostruzione fluorescenza con sovrapposto un co-registrato immagine anatomica CT dalla testa di un topo con un tumore U251 glioma ortotopica è presentato in figura 1b. Il centro di massa del glioma determinata dalla ricostruzione fluorescente (figura 1b ) era entro 1 mm dal centro tumore di massa determinata dal contrasto migliorare la risonanza magnetica (Figura 1a). Le immagini CT e MRI sono stati co-registrazione basato su un reciproco-informazioni di trasformazione. <img src="/files/ftp_upload/4050/4050fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Con mdc (gadolinio) immagine di risonanza magnetica della testa mouse (a). Il mouse è stato inoculato ortotopicamente con una linea cellulare umana glioma U251. La posizione del tumore, che assorbe l&#39;agente di contrasto più del cervello normale, può essere visto nel cerebrale sinistro (a destra in immagine) e indicato dalla freccia bianca. Il corresponding immagine tomografia computerizzata (dalla stessa posizione sulla testa mouse) è rappresentato in (b) con il fattore di crescita epidermico mirata fluorescenza meno il sovrapposta mirati ricostruzione fluorescenza. Le unità di fluorescenza sono in mm inverso e si riferiscono al coefficiente di assorbimento di fluorescenza associato mirata moltiplicato per la sua efficienza quantica e dalla sua concentrazione.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Fluorescenza tomografia (FT) è un sensibile, modalità di radiazioni ionizzanti senza l&#39;imaging molecolare basata su visibile e vicino infrarosso trasporto leggero attraverso il tessuto biologico. La maggior parte l&#39;interesse per FT si è concentrata sulla sua capacità di accelerare la scoperta di farmaci e lo sviluppo di piccoli animali in modelli sperimentali 1 e un settore chiave della ricerca è stato lo studio di espressione biomarker del cancro e la risposta alle terapie molecolari 26. Attualmente, ci sono due approcci concorrenti al sistema di progettazione FT. Il disegno più comune si basa su raffreddati charge-coupled device (CCD) per il rilevamento della fluorescenza 4-9. Questo design garantisce una elevata densità di misurazioni, massimizzando campionamento tessutale poiché ciascun pixel nella fotocamera CCD in grado di rilevare la luce che ha viaggiato un unico percorso attraverso il tessuto. Tuttavia, le telecamere CCD hanno una limitata gamma dinamica e rumore di lettura limita la loro sensibilità finale. Il secondo disegno evita la possibilità limitazioni<html> zioni di rilevamento della fotocamera CCD impiegando altamente sensibile a singolo fotone conteggio tecnologia basata sull&#39;uso di rivelatori come tubi fotomoltiplicatori o fotodiodi a valanga 10-13. Lo svantaggio di questi metodi di individuazione più sensibili è che ogni rivelatore può raccogliere la luce in un singolo punto, quindi, per ottenere campionamento denso tessuto, sia rivelatori molti devono essere utilizzati (che è molto costoso), oppure molte sporgenze devono essere esposte con lo stesso rivelatore (che può richiedere molto tempo). Mentre il livello ottimale di campionamento tessuto per FT piccolo animale non è stato concordato, e può variare caso per caso, si conviene che il singolo fotone strumentazione conteggio è più adatto per esplorare i limiti di sensibilità in termini di FT della sua capacità di rilevare basse concentrazioni di marcatori molecolari. In questo studio, forniamo una metodologia per la realizzazione FT utilizzando singoli fotoni strumentazione di rilevamento conteggio di localizzare i tumori nei topi. ENT &quot;&gt; Ci sono quattro passaggi critici coinvolti per la produzione di serie di dati robusti con il tempo-correlata single-photon FT conteggio. La prima è l&#39;applicazione di una procedura di calibrazione adatto e semplice. Nella metodologia presentata, le rispettive sensibilità di ciascun canale di rilevazione sono contabilizzate per la raccolta da una misura di base di luce di eccitazione trasmessa attraverso una linea-diffusore progettato per dirigere frazioni uguali di luce per ogni rivelatore 15. Inoltre, la luce rilevata durante un esperimento è continuamente tarato al laser di riferimento, sia in termini di intensità e significano . tempo, che può variare nel tempo, per il funzionamento di un canale di riferimento laser 11,15 La seconda fase critica è la raccolta accurata e co-registrazione di imaging anatomico per guidate ricostruzioni fluorescenza I dati FT offre non solo informazioni anatomiche.; Pertanto, al fine di creare un modello di trasporto luce che può essere utilizzato per ricostruire la lozione di sorgenti fluorescenti all&#39;interno di un campione dalla fluorescenza rilevata sulla superficie del campione, l&#39;anatomia del campione in relazione al sistema FT deve essere accuratamente conosciuto. Nel nostro sistema, le informazioni anatomico viene acquisita da un micro-tomografia computerizzata sistema di coordinate spaziali che sono stati registrati spazialmente con quelli del sistema FT 15,20. La terza fase critica significa anche garantire che una esposizione ottimale (cioè, il tempo totale di rilevamento di fotoni per ogni proiezione laser) è alle dipendenze di ogni fonte-rivelatore di posizione. Questo è importante per due ragioni: primo, per garantire che vi sia sufficiente di segnale-rumore in ciascuna posizione di rilevazione e secondo per evitare la saturazione rivelatore, che potrebbe danneggiare le unità di rilevamento. Al fine di ottenere l&#39;esposizione ottimale in ogni posizione rivelatore, un controllo automatico dell&#39;esposizione viene impiegato, che triangola essenzialmente ottimizzare l&#39;esposizione da due, bassa segnale esposizioni 14. La quarta criticapassaggio della metodologia fa riferimento ai dati raccolti fluorescenza alla quantità di luce trasmessa eccitazione. Questo riferimento viene spesso chiamato il rapporto Nato, e offre molti vantaggi per FT, con il principale dei quali una mitigazione del modello-dati gli errori di configurazione 23,24. Il sistema presentato è stato progettato per rilevare la luce di eccitazione sia fluorescenza e trasmette contemporaneamente incanalando la luce di ogni canale di rilevamento in 2 tubi fotomoltiplicatori separati. In questo modo, si evita qualsiasi effetto di movimento sulla precisione del rapporto Born. Con un robusto set di dati che a mano, la ricostruzione immagine del tempo nel dominio dei dati implica la soluzione del problema inverso della mesh ad elementi finiti con l&#39;espressione: d = Jx dove d è un vettore con n x m elementi per n source-rivelatore proiezioni e m TPSF tempo cancelli; J è un n x m-by-l sensibilità matrice (o Jacobiana), per i nodi l nel mesh, ed x è il vettore di fluorescenza proprietà ottiche in ciascun nodo, con l dimensione d è i dati calibrati raccolti durante l&#39;esperimento e J è simulato usando la soluzione di elemento finito. al ravvicinamento diffusione nel dominio del tempo di trasporto fluorescenza 25. La dimensione temporale di J è anche convoluta con le funzioni specifiche del rivelatore strumento di reazione. X è una rappresentazione della mappa fluorescenza di interesse ed è risolto per utilizzare un Levenberg Marqardt-non-negative almeno approccio quadrati con Tikhonov regolarizzazione 15. La metodologia qui presentata, che descrive un procedimento in grado di localizzare tumori fluorescente in topi usando altamente sensibili Photon Counting rivelazione di fluorescenza, ha il potenziale per spingere i limiti di FT. In uno studio precedente, il potenziale di impiegare questoapproccio larger-than-topi modelli animali, come i ratti, così come la sensibilità migliorata rispetto alla progettazione di sistemi esistenti in topo di dimensioni esemplari, è stata dimostrata 17. L&#39;applicazione immediata di questo approccio sarebbe per il monitoraggio di espressione biomarker in vivo in modelli animali di tumore di piccole dimensioni per valutare l&#39;efficacia dei farmaci in un high-throughput mezzi. La capacità del sistema per eccitare e rilevare fluorescenza a lunghezze d&#39;onda multiple permette la rilevazione simultanea di più marcatori fluorescenti. Altri marcatori fluorescenti fornire un mezzo di interrogare molteplici aspetti di una patologia, simultaneamente, o potrebbero essere utilizzati, come in questo studio, di impiegare metodi di imaging più quantitativi come dual-reporter metodi di misurazione in vivo potenziale di legame, un marker di densità recettore 26,27.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> IRDye 800CW-EGF </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-08446 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647, succinimidil estere </td><td> Life Technologies </td><td> A20106 </td><td> Reagito con acqua per ridurre il legame non specifico </td></tr></tbody></table>

computed tomography-guided time-domain diffuse fluorescence tomography in small animals for localization of cancer biomarkers

Piccoli animali di imaging di fluorescenza molecolare (FMI) può essere un potente strumento per la scoperta della droga preclinica e studi di sviluppo 1. Tuttavia, l&#39;assorbimento della luce da cromofori dei tessuti (ad esempio, l&#39;emoglobina, acqua, lipidi, la melanina) che stabilisce limiti propagazione ottica segnale attraverso spessori superiori a pochi millimetri 2. Rispetto ad altre lunghezze d&#39;onda visibili, l&#39;assorbimento del tessuto per il rosso e nel vicino infrarosso (near-IR) assorbimento della luce si riduce e non elastico di scattering della luce diventa il dominante del tessuto meccanismo di interazione. Lo sviluppo relativamente recente di agenti fluorescenti che assorbono ed emettono luce nel vicino-IR gamma (600-1000 nm), ha guidato lo sviluppo di sistemi di imaging e modelli di propagazione della luce che possono raggiungere tutto il corpo tridimensionale imaging in piccoli animali 3. Nonostante i grandi passi avanti in questo settore, la natura mal posto della tomografia di fluorescenza diffusa resta un importanteproblema per la stabilità, il recupero contrasto e la risoluzione spaziale delle tecniche di ricostruzione di immagine e l&#39;approccio ottimale per FMI nei piccoli animali deve essere ancora concordato. La maggior parte dei gruppi di ricerca hanno investito in charge-coupled device (CCD) basati su sistemi che forniscono abbondante la sensibilità dei tessuti di campionamento, ma non ottimale 4-9, mentre il nostro gruppo e pochi altri 10-13 hanno perseguito sistemi basati su rivelatori di sensibilità molto elevate , che in questo momento consentire campionamento tessuto denso essere raggiunta solo a costo di immagini a bassa velocità. Qui mostriamo la metodologia per l&#39;applicazione di singoli fotoni tecnologia di rilevamento in un sistema di tomografia di fluorescenza di localizzare una lesione cancerosa del cervello in un modello murino. La fluorescenza tomografia (FT) sistema impiegato fotone singolo conteggio utilizzando tubi fotomoltiplicatori (PMT) e ricco di informazioni nel dominio del tempo di rilevamento di luce in un non-contatto conformazione 11. Questo fornisce una simultanea colcolta di eccitazione e di emissione di luce trasmessa, e comprende il controllo dell&#39;esposizione automatica a fluorescenza di eccitazione 14, riferimenti laser, e co-registrazione con un piccolo animale tomografia computerizzata (microCT) del sistema 15. Un modello di topo nudo è stata utilizzata per l&#39;imaging. L&#39;animale è stato inoculato ortotopicamente con una linea cellulare umana glioma (U251), l&#39;emisfero cerebrale sinistro e ripreso 2 settimane dopo. Il tumore è stato fatto per fluorescenza mediante iniezione di un tracciante fluorescente, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) mirato al recettore del fattore di crescita epidermico, una proteina di membrana cellulare note per essere sovra-espresso nella linea U251 tumore e molti altri tumori 18. Un secondo, non mirati tracciante fluorescente, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) è stato anche iniettato per tenere conto di non-effetti mediati dal recettore per l&#39;adozione dei traccianti mirati a fornire un mezzo per quantificare vincolante tracciante e la disponibilità del recettore / densità 27. A CT-guidata, time-dominio algoritmo è stato utilizzato per ricostruire la posizione di entrambi traccianti fluorescenti (cioè, la posizione del tumore) nel cervello di topo e la loro capacità di localizzare il tumore è stato verificato mediante contrasto risonanza magnetica. Sebbene dimostrata per imaging di fluorescenza in un modello murino glioma, il metodo presentato in questo video può essere esteso a diversi modelli tumorali in vari modelli animali di piccole potenzialmente fino alle dimensioni di un topo 17.

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Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Diffuse la tomografia di fluorescenza offre un approccio relativamente a basso costo e potenzialmente ad alta dappertutto per preclinica<em&gt; In vivo</em&gt; Immagine del tumore. La metodologia di raccolta dei dati ottici, la calibratura e la ricostruzione delle immagini è presentato per una tomografia computerizzata guidata senza contatto nel dominio del tempo di sistema utilizzando il targeting fluorescente del tumore recettore fattore di crescita epidermico biomarker in un modello di glioma mouse.

Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.2K Views.  Dartmouth College. Diffuse la tomografia di fluorescenza offre un approccio relativamente a basso costo e potenzialmente ad alta dappertutto per preclinica In vivo Immagine del tumore. La metodologia di raccolta dei dati ottici, la calibratura e la ricostruzione delle immagini è presentato per una tomografia computerizzata guidata senza contatto nel dominio del tempo di sistema utilizzando il targeting fluorescente del tumore recettore fattore di crescita epidermico biomarke...

Video: Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for imaging vasculature, few are able to visualize the vascular network as a whole while extending to a resolution that includes the smaller vessels1,2. Additionally, many vascular casting techniques destroy the surrounding tissue, preventing further analysis of the sample3-5. One method which circumvents these issues is micro-Computed Tomography (&mu;CT). &mu;CT imaging can scan at resolutions &lt;10 microns, is capable of producing 3D reconstructions of the vascular network, and leaves the tissue intact for subsequent analysis (e.g., histology and morphometry)6-11. However, imaging vessels by ex vivo &mu;CT methods requires that the vessels be filled with a radiopaque compound. As such, the accurate representation of vasculature produced by &mu;CT imaging is contingent upon reliable and complete filling of the vessels. In this protocol, we describe a technique for filling mouse coronary vessels in preparation for &mu;CT imaging.
Two predominate techniques exist for filling the coronary vasculature: in vivo via cannulation and retrograde perfusion of the aorta (or a branch off the aortic arch) 12-14, or ex vivo via a Langendorff perfusion system 15-17. Here we describe an in vivo aortic cannulation method which has been specifically designed to ensure filling of all vessels. We use a low viscosity radiopaque compound called Microfil which can perfuse through the smallest vessels to fill all the capillaries, as well as both the arterial and venous sides of the vascular network. Vessels are perfused with buffer using a pressurized perfusion system, and then filled with Microfil. To ensure that Microfil fills the small higher resistance vessels, we ligate the large branches emanating from the aorta, which diverts the Microfil into the coronaries. Once filling is complete, to prevent the elastic nature of cardiac tissue from squeezing Microfil out of some vessels, we ligate accessible major vascular exit points immediately after filling. Therefore, our technique is optimized for complete filling and maximum retention of the filling agent, enabling visualization of the complete coronary vascular network &#x2013; arteries, capillaries, and veins alike.

Visualization of the coronary vessels is critical to advancing our understanding of cardiovascular diseases. Here we describe a method for perfusing murine coronary vasculature with a radiopaque silicone rubber (Microfil), in preparation for micro-Computed Tomography (&mu;CT) imaging.

Perfusione retrograda e riempimento del sistema vascolare coronarico mouse come preparazione per la Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

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Medicina

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Valutazione della solidità del grasso umano iniezione in topi nudi con Micro-Tomografia Computerizzata

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Utilizzando la tomografia micro-computerizzata per la valutazione di sviluppo del tumore e follow-up di risposta al trattamento in un modello murino di cancro ai polmoni

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Disposable Dosators for Pulmonary Insufflation of Therapeutic Agents to Small Animals

Development of new therapeutic products requires efficacy testing in an animal model. The pulmonary route of administration can be utilized to deliver drugs locally and systemically. Evaluation of dry powder aerosols necessitates an efficient dispersion mechanism to maintain high concentrations in an exposure chamber or for direct endotracheal administration. While solutions exist to expose animals by passive inhalation to dry powder aerosols, most require masses of powder in large excess of the dose delivered. This precludes conducting early feasibility studies as insufficient drug is available at the research or early development stage to support the dose delivery requirements for conventional aerosol delivery systems. When designing an aerosol drug product, aerodynamic performance can relate directly to delivery efficiency and efficacy. Dispersion of powder into an aerosol requires energy input sufficient to overcome interparticulate forces, and particle engineering approaches can substantially improve aerosol performance. We have developed a dispersion system (dosator) which can aerosolize engineered dry powder aerosols efficiently for the purpose of direct pulmonary insufflation, dispersion into an exposure system or generation for analytical purposes.

During development of drugs for pulmonary delivery, it is necessary to evaluate pharmacokinetics and efficacy in an animal model. We present a method to build a disposable aerosol dispersion system from of-the-shelf components that can be used to administer intrapulmonary dry powder aerosol to rodents.

Monouso Dosators per insufflazione polmonare di agenti terapeutici ai piccoli animali

Development of new therapeutic products requires efficacy testing in an animal model. The pulmonary route of administration can be utilized to deliver ...

Cone Beam Intraoperative Computed Tomography-based Image Guidance for Minimally Invasive Transforaminal Interbody Fusion

Transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF) is commonly used for the treatment of spinal stenosis, degenerative disc disease, and spondylolisthesis. Minimally invasive surgery (MIS) approaches have been applied to this technique with an associated decrease in estimated blood loss (EBL), length of hospital stay, and infection rates, while preserving outcomes with traditional open surgery. Previous MIS TLIF techniques involve significant fluoroscopy that subjects the patient, surgeon, and operating room staff to non-trivial levels of radiation exposure, particularly for complex multi-level procedures. We present a technique that utilizes an intraoperative computed tomography (CT) scan to aid in placement of pedicle screws, followed by traditional fluoroscopy for confirmation of cage placement. Patients are positioned in the standard fashion and a reference arc is placed in the posterior superior iliac spine (PSIS) followed by intraoperative CT scan. This allows for image-guidance-based placement of pedicle screws through a one-inch skin incision on each side. Unlike traditional MIS-TLIF that requires significant fluoroscopic imaging during this stage, the operation can now be performed without any additional radiation exposure to the patient or operating room staff. After completion of the facetectomy and discectomy, final TLIF cage placement is confirmed with fluoroscopy. This technique has the potential to decrease operative time and minimize total radiation exposure.

The purpose of this article is to provide image-guidance for minimally invasive transforaminal interbody fusion.

Guida all'immagine basata sulla tomografia computerizzata del fascio di cono per la fusione intercorpale trasforale mini-invasiva

Transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF) is commonly used for the treatment of spinal stenosis, degenerative disc disease, and spondylolisthesis. ...

Identifying Coronary Artery Calcification on Non-gated Computed Tomography Scans

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed tomography (CT) scans with a high correlation with gated cardiac CT scans. This standardized protocol takes a step-wise approach to not only optimizing an image for the identification of calcification but also to distinguishing CAC from other common causes of calcification in the cardiac silhouette. Recognition of CAC on non-gated CT scans helps to identify a very powerful prognostic factor that can influence therapeutic interventions or downstream diagnostic testing without requiring a gated cardiac scan. These non-gated CT scans are often acquired as part of the routine care of the patient, and this data is readily available without another dose of&#160;ionizing radiation. This protocol allows for the precise and accurate extraction of this data for the purposes of retrospective data analysis in clinical research studies, but also in the clinical evaluation and management of patients.

Here, we present a protocol to reliably and systematically identify coronary artery calcification (CAC) on non-gated computed tomography (CT) scans of the chest or abdomen. CAC provides an objective measure of coronary artery disease for both research and clinical purposes.

Identificazione di calcificazione dell'arteria coronaria su Non-gated scansioni con tomografia computerizzata

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal blood time-activity concentration also known as arterial input function (AIF) is a key point, especially for the characterization of animal disease models and the introduction of newly developed radiotracers. The knowledge of radiotracer availability in the blood helps to interpret PET/CT-derived data of tissue activity. For this purpose, online blood sampling during the PET/CT imaging is advisable to measure the AIF. In contrast to manual blood sampling and image-derived approaches, continuous online blood sampling has several advantages. Besides the minimized blood loss, there is an improved resolution and a superior accuracy for the blood activity measurement. However, the major drawback of online blood sampling is the costly and time-consuming preparation to catheterize the femoral vessels of the animal. Here, we describe an easy and complete workflow for catheterization and continuous blood sampling during small animal PET/CT imaging and compared it to manual blood sampling and an image-derived approach. Using this highly-standardized workflow, the determination of the fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) AIF is demonstrated. Further, this procedure can be applied to any radiotracer in combination with different animal models to create fundamental knowledge of tracer kinetic and model characteristics. This allows a more precise evaluation of the behavior of pharmaceuticals, both for diagnostic and therapeutic approaches in the preclinical research of oncological, neurodegenerative and myocardial diseases.

Here a protocol for continuous blood sampling during PET/CT imaging of rats to measure the arterial input function (AIF) is described. The catheterization, the calibration and setup of the system and the data analysis of the blood radioactivity are demonstrated. The generated data provide input parameters for subsequent bio-kinetic modeling.

Il campionamento continuo del sangue nella tomografia a emissione di positroni di piccole dimensioni/tomografia computerizzata consente la misurazione della funzione di input arteriosa

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...

Four-Dimensional Computed Tomography-Guided Valve Sizing for Transcatheter Pulmonary Valve Replacement

The measurements of the right ventricle (RV) and pulmonary artery (PA), for selecting the optimal prosthesis size for transcatheter pulmonary valve replacement (TPVR), vary considerably. Three-dimensional (3D) computed tomography (CT) imaging for device size prediction is insufficient to assess the displacement of the right ventricular outflow tract (RVOT) and PA, which could increase the risk of stent misplacement and paravalvular leak. The aim of this study is to provide a dynamic model to visualize and quantify the anatomy of the RVOT to PA over the entire cardiac cycle by four-dimensional (4D) cardiac CT reconstruction to obtain an accurate quantitative evaluation of the required valve size. In this pilot study, cardiac CT from sheep J was chosen to illustrate the procedures. 3D cardiac CT was imported into 3D reconstruction software to build a 4D sequence which was divided into eleven frames over the cardiac cycle to visualize the deformation of the heart. Diameter, cross-sectional area, and circumference of five imaging planes at the main PA, sinotubular junction, sinus, basal plane of the pulmonary valve (BPV), and RVOT were measured at each frame in 4D straightened models prior to valve implantation to predict the valve size. Meanwhile, dynamic changes in the RV volume were also measured to evaluate right ventricular ejection fraction (RVEF). 3D measurements at the end of the diastole were obtained for comparison with the 4D measurements. In sheep J, 4D CT measurements from the straightened model resulted in the same choice of valve size for TPVR (30 mm) as 3D measurements. The RVEF of sheep J from pre-CT was 62.1 %. In contrast with 3D CT, the straightened 4D reconstruction model not only enabled accurate prediction for valve size selection for TPVR but also provided an ideal virtual reality, thus presenting a promising method for TPVR and the innovation of TPVR devices.

This study assessed a new methodology with a straightened model generated from the four-dimensional cardiac computed tomography sequence to obtain the desired measurements for valve sizing in the application of transcatheter pulmonary valve replacement.

Dimensionamento della valvola guidata da tomografia computerizzata quadridimensionale per la sostituzione della valvola polmonare transcatetere

The measurements of the right ventricle (RV) and pulmonary artery (PA), for selecting the optimal prosthesis size for transcatheter pulmonary valve ...