DZ è supportato dal MD Anderson Cancer Center e sovvenzioni NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center è supportato in parte dal NIH sovvenzione CA16672.

1. Lab di sicurezza Preoccupazioni <ol><li> Tutti i solventi organici devono essere conservati in aree specifiche con una chiara etichettatura. Vedi le etichette dai produttori per i tipi di estintori richiesti. </li><li> Diversi reagenti utilizzati sono potenzialmente cancerogeni e possono causare depressione mentale. Questi reagenti devono essere manipolati in una cappa chimica con ventilazione (Vedi tabella di reagenti e attrezzature specifiche per le specifiche). </li><li> Si raccomanda che quando si lavora con solventi organici e le cellule, dispositivi di protezione individuale quali guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione, essere utilizzati in ogni momento. </li></ol> 2. Estrazione di glicosfingolipidi da cellule leucemiche Rat <ol><li> Negozio RBL ratto cellule leucemiche 8 (da 10 a 100 milioni) in tubi di diametro 16x100 vetro sotto -80 ° C condizioni. Le cellule vengono conteggiate da un emocitometro dopo colorazione con trypan blue. Vitalità delle cellule deve essere superiore al 95%. </li><li> Estrarre i lipidi utilizzando sonicat vastaagli ioni di quattro volte per 1-2 ore ciascuno con solventi di polarità miste. Utilizzare 6 ml di cloroformio-metanolo 1:1 (v / v) come solvente e cognome. Sei ml di isopropanolo: esano: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, rimuovere fase superiore per aspirazione prima dell&#39;uso) può quindi essere utilizzato come solvente secondo e terzo. Questo solvente viene preparata miscelando isopropanolo: esano: H 2 O in un rapporto 55:25:20, agitando vigorosamente, e consentendo una fase superiore a comparire, che saranno rimossi. Mantenere la fase inferiore per l&#39;uso. </li><li> Segui sonicazione con centrifugazione per pellet il materiale insolubile. I supernatanti. Asciugare in un SpeedVac per 4 h. Flusso di azoto o evaporatore rotante può essere usato se SpeedVac è più disponibile. Utilizzare una buona trappola fredda per tenere evaporate solventi organici. Contaminazione del solvente organico in olio pompa di vuoto si degrada il rendimento della pompa da vuoto. </li><li> Eseguire un&#39;analisi preliminare utilizzando alte prestazioni cromatografia su strato sottile (HPTLC). Per quantificare glicolipidi, Preparare un 0,2% orcinol in soluzione al 50% di acido solforico (100 mg in 50 ml) e uno standard Galattosio (40 mg in 100 ml di soluzione stock). Preparare in 30 pl di volume di reazione di una serie di diluizioni da utilizzare come curva standard (da 0 g / L a 20 g / L). Aggiungere 20 ml di metanolo per ogni campione serie di diluizione. Sciogliere ogni campione glicolipide in 200 ml di metanolo, ultrasuoni, e utilizzare 20 pl per la misurazione della quantità di glicolipidi. In 1,5 ml provette Eppendorf con tappo a vite (Sarstedt, 72.692.005), aggiungere 0,4 ml di 0,2% in orcinol 50% soluzione di acido solforico per ogni campione, con una serie di galattosio-H 2 O-metanolo soluzioni che servono per la curva standard . Bollire per 5 minuti nel blocco di riscaldamento a 100 ° C. Leggere la densità ottica di reazione colorimetrica a 440 nm con Alba Tecan lettore di micropiastre. Effettuare HPTLC, utilizzare cloroformio: metanolo: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) come solvente per i lipidi neutri trattati con cloroformio-metanolo 1:1 (v / v). Utilizzare isopropanolo: esano: H 2 O 55:25:20 (v / v / v) comeil solvente per i lipidi acidi (gangliosidi). Le GSLs neutro isolato è stato disciolto in 200 microlitri solvente cloroformio: metanolo 1:1 (v / v) e caricato sulla piastra di silice Merck cromatografia su strato sottile di gel Microcaps Drummond. Le piastre sono state eseguite in solvente cloroformio: metanolo: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) ed essiccato. I glicosfingolipidi sono state visualizzate mediante orcinol-acido solforico a 300 ° C. </li><li> Al fine di separare i lipidi neutri dai lipidi acidi, frazione fuori i lipidi neutri ed acidi mediante cromatografia a scambio anionico su una piccola colonna di DEAE Sephadex A-25 [il DEAE Sephadex A25 resina può essere preparato immergendo Sephadex A-25 resina polvere in cloroformio: metanolo: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) per una notte. Aspirare il supernatante fino a quando la resina Sephadex A25 è tutto ciò che rimane. Aggiungi fresco cloroformio: metanolo: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) per lavare la resina. Ripetere tre volte per rimuovere i residui caricati negativamente da Sephadex A25] resina. </li><li> Sciogliere, Ultrasuoni (per non più di 10 minuti), e risospendere i lipidi dal passo 2.1 in cloroformio: metanolo: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) quando necessario. </li><li> Preparare una piccola DEAE Sephadex A25 (Cl Form) colonna utilizzando lana di vetro e un 9 &quot;pipetta Pasteur. Imballare la lana di vetro con attenzione in modo che la polvere di resina non passa attraverso la colonna. Aggiungi DEAE Sephadex A25 (modulo Cl) alla resina&quot; collo &quot;del 9&quot; pipetta Pasteur senza lasciare che la colonna a secco. Assicurarsi che non si vede alcun resina in eluente. I campioni sciolti in cloroformio: metanolo: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) sono stati sciolti. La frazione lipidica neutra è il flusso attraverso frazione. </li><li> Eluire la frazione lipidica acida (legato alle resine) con 8 ml di acetato di sodio in metanolo. Asciugare entrambe le frazioni neutri e acidi, desalificare loro da dialisi, asciugarle con SpeedVac e analizzarli da HPTLC. </li></ol> La frazione acida contiene gangliosidi, che possono essere dializzati per la Fase 3 reazione direttamente.La frazione neutra contiene non solo glicosfingolipidi neutri, ma anche (fosfatidilcolina e sfingomielina), che devono essere rimossi da una reazione di acetilazione. Nella nostra esperienza, il metodo di una cassetta di dialisi, è più efficiente e conveniente di un tubo di dialisi o fase inversa C18 cromatografia su colonna. <ol start="9"><li> Il passo successivo è la rimozione dei fosfolipidi dalla glicosfingolipidi neutri da una reazione di acetilazione e peracetylation. Essiccare il DEAE Sephadex A-25 pass-through frazione nel SpeedVac (con raffreddamento) per 4 h. Dopo che i campioni sono secchi, metterli di nuovo nel SpeedVac e asciutto per un altro h 4. Assicurarsi che questi campioni sono completamente asciutti, come l&#39;acqua residua impedisce la reazione peracetylation. </li><li> Peracetylate i campioni con 1 ml di piridina e 0,5 ml di anidride acetica al buio a temperatura ambiente oa 37 ° C per una notte. Questa quantità di anidride acetica e piridina è corretta finoa 200 pg di glicosfingolipidi. Questa reazione può essere effettuata a 37 ° C, come i GSLs hanno una migliore solubilità. </li><li> Asciugare il materiale da peracetylated SpeedVac per 3 ore, con l&#39;aggiunta di 1 ml di toluene 3x (coevaporation) per garantire la completa evaporazione. Se i campioni non sono ancora completamente asciutto, SpeedVac fino a secco. </li><li> Preparare una (Sigma-Aldrich) Florisil colonna (30-60, maglia 10 × 80 mm) in una pipetta Pasteur con lana di vetro, utilizzando perline Florisil. Perline Florisil deve essere completamente asciutta prima dell&#39;uso, da incubazione in un forno a 110 ° C. Riempire le perle nella pipetta Pasteur fino al collo, ed equilibrare in 1,2-dicloroetano-esano 4:1 (v / v). </li></ol> Eluizione dalla colonna Florisil è molto veloce. Volatilità rapida dei solventi può portare a essiccazione colonna. Pertanto tutte le miscele di solventi deve essere preparato prima di eseguire la colonna in quanto non è possibile fermare la colonna durante l&#39;eluizione. <ol start="13"><li> Applicare il peracetylated campione in 1 ml di 1,2-dicloroetano-esano 4:1 (v / v), e lavare la colonna con 6 ml del solvente stesso, seguiti da 10 ml di 1,2-dicloroetano. Eluire neutri GSLs peracetylated con 6 ml di 1,2-dicloroetano-acetone 1:1 (v / v). Questo passaggio rimuove i fosfolipidi peracetylated di glicosfingolipidi, in quanto i glicosfingolipidi peracetylated legherà la colonna Florisil, mentre fosfolipidi peracetylated non lo fanno. </li><li> Asciugare le frazioni da SpeedVac per 2 ore e deacetylate con 2 ml di 0,5 M sodio metossido [Sigma-Aldrich, 403.067] in 2 ml di metanolo per 3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Neutralizzare la miscela con 3 ml di soluzione metanolica di acido acetico [acetico / metanolo 15/85 v / v], essiccare SpeedVac, desalt da dialisi [Sciogliere i prodotti essiccati in 3 ml di acqua, e iniettare nella Slide-A-lizzatore Cassette Dialisi, dializza contro l&#39;acqua per 24 ore. Cambiare l&#39;acqua almeno due volte]. Asciugare i GSLs dializzati (in soluzione acquosa) di SpeedVac fino a quando i campioni sono completamente asciutti. </li&gt; </ol> 3. Modificazione chimica (Permethylation) di glicosfingolipidi 13 <ol><li> Introdurre GSLs (1-20 mg) ad un tubo di vetro con tappo a vite e rivestimento Teflon, e aggiungere dimetilsolfossido (150 microlitri) senza utilizzare particolari condizioni di essiccamento o in atmosfera di gas inerte. </li><li> Preparare idrossido di sodio in polvere (40-60 mg) di particelle di idrossido di sodio macinandoli in un mortaio chimico con un pestello. Assicurarsi di conservare le polveri in un ambiente molto asciutto e stare attenti a fare la rettifica della cappa per evitare di respirare le polveri. </li><li> Successivamente aggiungere la polvere di idrossido di sodio alla soluzione campione con una spatola. Aggiungi iodometano (80 microlitri) con 100 microlitri Halmilton siringa, [o 100 microlitri VWR calibrato pipetta collegata ad una siringa attraverso il tubo di gomma può essere usato], e agitare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Estinguere la reazione di metilazione con acqua (2 ml). Estrarre i prodotti permethylated 3 volte dal&#39;aggiunta di diclorometano (2 ml) [glicolipidi sono in fase di diclorometano, che è la fase inferiore, quindi la fase superiore può essere trasferito in una nuova provetta, ed estratta nuovamente con diclorometano]. </li><li> Lavare il diclorometano combinato estrae 3 volte con 2 ml di acqua [la fase superiore, che è l&#39;acqua, può quindi essere smaltiti]. Termine del lavaggio finale, trasferire i campioni in una nuova provetta, e asciugare con il SpeedVac. </li><li> Campioni può essere sciolto in 100-200 ml di metanolo per ESI-MS. </li></ol> 4. MALDI-TOF Analisi delle Gycosphingolipids Permethylated <ol><li> Eseguire MALDI-TOF-MS e MALDI-TOF/TOF-MS/MS esperimenti su un TOF-TOF MALDI spettrometro di massa (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Preparare la matrice mescolando 50% volume di 10 mg / ml di acido diidrossibenzoico (DHB) in acetonitrile e 50% volume di 0,1% acido trifluoroacetico (TFA) in acqua. </li><li> La matrice DHB possono essere individuati sul Targe MALDIt (1 pl), seguito da un pl 1 (contenente 100 ng GSLs) posto di campione disciolto in metanolo. Applicare lentamente e lasciarlo asciugare prima dell&#39;analisi. </li></ol> 5. Ion Trap Analisi MS di glicosfingolipidi Permethylated <ol><li> Eseguire la spettrometria di massa su una lineare spettrometro di massa trappola ionica (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) utilizzando una sorgente nanoelectrospray, 0,30 microlitri / min portata a 230 ° C di temperatura capillare in modalità ioni positivi con l&#39;energia di collisione 30-50%. Impostare energie di collisione per lasciare un abbondanza minima residua di ioni precursore. Rilevare tutti gli ioni come addotti di sodio. </li><li> Identificare il iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) in una miscela isobarica di Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) norme confrontando i diversi modelli di MS 4 ioni prodotto dalla sodiated ione molecolare attraverso il frammento glicano m / z 667 e il disaccaride terminale 1 - ene ione m / z 445 (vale a direX → 667 → 445 →, X indica lo ione molecolare rilevata MS 1) di puro permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standard tramite ESI-LIT-MS con quelli di permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ è un consulente per BioTex, Houston, TX, e un inventore coinvolti in brevetti relativi alle tecnologie di cui al presente articolo, rilasciati o in applicazione.

Il glycome, un termine coniato in analogia al genoma e del proteoma, si riferisce a tutte le strutture di un organismo saccaridi. Per comprendere pienamente le molteplici funzioni della glicosilazione richiederà un approccio integrato che comprende entrambi gli studi funzionali e strutturali glicomica. Entrambi sono complicate dal non-template natura driven di biosintesi glicano, la conseguente complessità e la diversità delle strutture glycan, frequente coinvolgimento di struttura aglicone nel modulare glycan interazioni ligando-recettore a livello molecolare, e l&#39;importanza funzionale di ligandi poco abbondanti. E &#39;generalmente accettato che la spettrometria di massa (MS) è un metodo indispensabile per studi strutturali glicomica, soprattutto per identificare e caratterizzare ligandi poco abbondanti. Per osservare glicani o glicoconiugati come specie molecolari, che spesso utilizza una ad alta efficienza, bassa energia di ionizzazione metodo, chiamato ionizzazione elettrospray (ESI). Per maggiori detaffliggesse caratterizzazione della struttura glicano, è essenziale selezionare singole specie molecolari e rompere i glicani in piccoli pezzi. Questo avviene normalmente in seguito a collisione indotta dissociazione, che prevede l&#39;attivazione dei glicani di collisioni con le molecole di gas inerti. L&#39;aumento di energia induce rottura legame, e l&#39;analisi sistematica dei frammenti risultanti fornisce informazioni sulla struttura molecolare del glicano. Spesso, &quot;firma&quot; frammenti possono essere generati che sono diagnostici per particolari caratteristiche glycan strutturali. Insieme con la massa molecolare, questi frammenti possono talvolta essere sufficienti per identificare glicani, ma in passato molte più informazioni è stato richiesto per caratterizzare pienamente, in particolare se la struttura è nuova. Questi metodi comprendono analisi della composizione dello zucchero, l&#39;analisi dei gas cromatografia spettrometria di massa parzialmente metilati acetati alditolo per analisi di linkage, e la digestione glicosidasi specifiche 17. 18-19, vari cicli di frammentazione bassa energia, che può essere svolta effettivamente in una trappola ionica spettrometro di massa (IT-MS), migliora notevolmente la resa informazioni dall&#39;analisi spettrale di massa glicano . Con quattro o cinque giri di frammentazione (che non può essere fatto con altri strumenti MS), è possibile distinguere glicani isomeriche che contengono i componenti zucchero stessi disposti in legami zucchero differenti, anche quando questi sono presenti insieme in miscele di componenti con la stessa massa molecolare (isobare). Per questa analisi, i glicani erano derivatizzato, in sostituzione di tutti i gruppi ossidrilici liberi con gruppi metilici, usando permethylation. Mentre l&#39;assegnazione strutturale dei glicani è possibile senza permethylation, il permethylation aumenta la sensibilità 17. Levery e Zhou, hanno unito tutti i vantaggi potenziali di IT-MS metodologia, compresa l&#39;individuazione delle isomerica structures utilizzando ioni firma diagnostici, osservabili solo in MS 4 e MS 5 spettri, per l&#39;identificazione ad alta sensibilità e la quantificazione di glicosfingolipidi presenti in forma di miscele multiple isobariche 7-9. In teoria, si può essere in grado di identificare ogni struttura esistente glicolipidi, in attesa della disponibilità di glicolipidi standard, che possono essere sintetizzati chimicamente. I passi fondamentali di questa analisi sono il tasso di recupero GSLs da campioni biologici. Tipicamente 80 pg di GSL può essere recuperato da 100 milioni di cellule tumorali come RBL. Per generare sufficienti ioni molecolari per vari cicli di frammentazione in trappola ionica spettrometri di massa, almeno 10 microgrammi di GSLs tumorali sono obbligatori. Bassa resa di GSLs durante la purificazione porterà a bassa abbondanza di ioni, che non possono essere sottoposti a un&#39;ulteriore frammentazione. Il successo dell&#39;analisi dipende dalla quantità di GSLs che vengono recuperati. In genere, finale concentration di GSLs permethylated dovrebbe raggiungere 1 mg / ml, disciolto in metanolo, prima di essere analizzato su un nano-elettrospray sorgente. Il limite per una approfondita analisi MS n dipende l&#39;abbondanza di ione specifico in MS 1 profilo. Un tipico e 7 abbondanza di ioni è richiesto per una approfondita analisi MS 5. La bassa resa di GSLs durante la purificazione può essere causata dalla perdita di GSLs durante la fase peracetylation (che rimuove i fosfolipidi), quando le per-acetilati GSLs deve essere associato a cromatografia su colonna di resina Florisil, lavato, e successivamente eluito. Per garantire il legame di per-acetilati GSLs al gel di silice, i campioni dovrebbero essere ricaricato due volte alla colonna di cromatografia dopo scorre attraverso.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glicosfingolipidi (GSL) appartengono alla classe di glicoconiugato biomacromolecole, che portano le informazioni strutturali di importanti processi biologici quali lo sviluppo embrionale, la trasduzione del segnale, e il riconoscimento del recettore immunitario 1-2. Essi contengono frazioni di zucchero complessi in forma di isomeri e frazioni di lipidi con variazioni comprese lunghezza grassi a catena acilica, insaturazione, e idrossilazione. Entrambe le porzioni di carboidrati e ceramide possono essere base di significato biologico. Per esempio, tri-hexosylceramides includono globotriaosilceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), che hanno masse molecolari identiche ma collegamenti zucchero distinti di parte di carboidrato, responsabile delle funzioni biologiche completamente diverse 3-4. In un altro esempio, è stato dimostrato che la modifica della parte ceramide di alfa-galactosylceramide, un ligando potente agonista per invariformica cellule NKT, cambi i loro profili di secrezione di citochine e la funzione in modelli animali di cancro e malattie autoimmuni 5. La difficoltà di eseguire una analisi strutturale di isomeri in organi e cellule immunitarie fungere da barriera per determinare molte funzioni biologiche 6. Qui, presentiamo una versione visualizzata di un metodo per l&#39;analisi relativamente semplice, rapido e sensibile di profili glicosfingolipidi nelle cellule immunitarie 7-9. Questo metodo si basa sulla modificazione estrazione e chimica (permethylation, vedi sotto figura 5A, tutti i gruppi OH di esosi sono stati sostituiti da MeO dopo reazione permethylation) di glicosfingolipidi 10-15, seguita da analisi successive utilizzando matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione time- di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS) e spettrometria di massa di ioni trappola. Questo metodo richiede 50 milioni di cellule immunitarie per un&#39;analisi completa. Gli esperimenti possono essere completate entro una settimana. L&#39;abbondanza relativa dei glicosfingolipidi varie possono essere delineati rispetto agli standard di sintesi. Questo metodo ha una sensibilità di misurazione 1% iGb3 tra Gb3 isomeri, quando due fmol del totale iGb3/Gb3 miscela è presente 9. Spettrometria di massa a trappola ionica può essere utilizzato per analizzare isomeri. Ad esempio, per analizzare la presenza di globotriaosilceramide e isoglobtriaosylceramide nello stesso campione, si può usare la frammentazione di molecole strutturalmente glicosfingolipidi di discriminare tra i due (vedi sotto Figura 5). Inoltre, la modificazione chimica delle frazioni di zucchero (tramite una reazione permethylation) migliora la ionizzazione e l&#39;efficienza di frammentazione di maggiore sensibilità e specificità, e aumenta la stabilità di residui di acido sialico. La modificazione chimica di estrazione e glicosfingolipidi può essere eseguita in un classico cappa chimica certificata, e la spettrometria di massa può essere eseguita da nucleoimpianti con trappola ionica strumenti MS.

Un esempio di analisi MALDI MS dei glicosfingolipidi di RBL leucemia linea di cellule di ratto (un tipo di cellula che presenta l&#39;antigene che presenta antigeni glicosfingolipidi a cellule NKT) è mostrato in Figura 3. Gli ioni possono essere assegnati a specifiche strutture glicosfingolipidi (Figura 3A). Nelle cellule trattate con RBL NB-DGJ 16, un farmaco che inibisce la sintesi glicosfingolipidi, riduzione significativa di tutti glicosfingolipidi stato osservato (Figura 3B). Isomeri strutturali non possono essere distinte. La MS / MS capacità della Applied Biosystems 4700 permette la frammentazione di ioni MS1 a MS 2 frammenti, permettendo limitato informazioni strutturali da generare. Tuttavia, l&#39;analisi MS2 spesso non è sufficiente a discriminare isomeri oligosaccaridi. La trappola ionica analisi MS di glicosfingolipidi consente lo studio di isomeri, come iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) e Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) che possono esistere come gli ioni trihexosylceramide rilevati in Figura 3A. Per rilevare tali isomeri, standard e iGb3 Gb3 sono stati analizzati da vari cicli di frammentazione, finché sono state riscontrate differenze (Figure 4A e 4B). Nell&#39;esempio qui presentato (Figura 5C) iGb3 e Gb3 potrebbe essere discriminati confrontando la norma iGb3 e Gb3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di estrazione glicosfingolipide e modificazione chimica di glicosfingolipidi (permethylation). Glicosfingolipidi sono stati estratti dalle cellule da solventi organici. Per rimuovere non glicosfingolipidi, lipidi può essere peracetylated e deacetilato. Secondo, glicosfingolipidi sono stati modificati chimicamente mediante una reazione permethylation, che migliora la sensibilità e la specificità di MS detection. Infine, i profili glicosfingolipidi sono stati determinati utilizzando MALDI-TOF e spettrometria di massa a trappola ionica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figura 2. Quantificazione glicosfingolipidi da orcinol Metodo Acido solforico: Quantificazione dei glicosfingolipidi con un 0,2% orcinol in soluzione al 50% di acido solforico e una curva standard di glucosio. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figura 3. Glycosphingolipidomics di cellule leucemiche ratto A. rappresentativa spettro di massa MALDI;. Ogni ione rappresenta una struttura specifica glicosfingolipidi, isomeri strutturali non possono essere distinti B. NB-DGJ, un farmaco che inibisce la sintesi glicosfingolipidi, s.riduce ignificantly tutti i glicosfingolipidi prodotte in cellule RBL. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figura 4. Tandem Mass Spectrometry di isomeri di glicosfingolipidi. Percorsi di decomposizione A. caratteristici per la spettrometria di massa di ioni positivi trappola modo di GSLs permethylated I 3 Cer e IGB 3 Cer. Gb 3 e IGB 3 sono nettamente separati dai loro modelli di frammentazione. Le differenze di linkage si riflettono nei 4 ioni prodotto MS coerenti con le isobariche m / z 445 precursori. B. Risultati rappresentativi mostrano iGB3 può essere misurata in una miscela di isomeri iGb3/Gb3. Stelle indicare ioni diagnostici per iGb3 solo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per</a>ingrandisci figura. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figura 5. Ion trap MS permette l&#39;analisi di isomeri di glicosfingolipidi. A. standard iGb3 e spettacolo differenza Gb3 del profilo frammentazione dopo 4 turni di frammentazione in uno spettrometro di massa a trappola ionica LTQ. B. Caratteristica MS 4 profilo di ioni derivati ​​da iGb3 o Gb3. C. Trihexosyleramides sono miscele di iGb3 e Gb3 isomeri che possono essere identificati con trappola ionica MS metodo (Figura da Dapeng Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Un metodo specifico e sensibile al fine di conoscere il profilo di espressione di antigeni glicosfingolipidi in organi e cellule immunitarie è descritto. Il metodo sfrutta la spettrometria di massa a trappola ionica consentendo graduale frammentazione delle molecole glicosfingolipidi per l&#39;analisi strutturale rispetto agli standard sintetizzati chimicamente.

Spettrometria di massa, di antigeni glicosfingolipide

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

mass-spectrometric-analysis-of-glycosphingolipid-antigens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K Views.  Rice University. Un metodo specifico e sensibile al fine di conoscere il profilo di espressione di antigeni glicosfingolipidi in organi e cellule immunitarie è descritto. Il metodo sfrutta la spettrometria di massa a trappola ionica consentendo graduale frammentazione delle molecole glicosfingolipidi per l'analisi strutturale rispetto agli standard sintetizzati chimicamente.