Sostenuto in parte da Vanderbilt CTSA sovvenzione 1 UL1 RR024975 dal Centro nazionale per le risorse di ricerca, National Institutes of Health. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.

Per il seguente protocollo, usiamo le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come le cellule di interesse. Tuttavia, questo protocollo può essere usato con altri tipi di cellule. Eseguire il test in una cappa coltura di tessuti con tecnica sterile. Giorno 1: Preparazione della piastra e celle <ol><li> Estrarre una piastra ELISPOT e aprirlo nel cappuccio. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con 150 ml di PBS 1X utilizzando una pipetta multicanale, se disponibile, altrimenti solo pipettaggio bene è accettabile. </li><li> Prendete un pacchetto di serbatoi e aprirlo nel cofano. </li><li> Aggiungere 2 mg / mL di anticorpo di cattura, anti-umano interferone-γ, a 11 ml di PBS 1X. Vortex bene. Trasferimento mix di anticorpi ad un serbatoio. </li><li> Mettere 100 microlitri della soluzione del rivestimento in ciascun pozzetto utilizzando il multicanale. </li><li> Avvolgere la piastra in parafilm. </li><li> Porre la piastra in frigorifero per una notte. Le piastre sono buone per settimane. La regola generale è che se c&#39;è ancora lasciato liquido nei pozzi, la lastra può essere utilizzato. </li></ol> Preparazione delle cellule Se i PBMC sono freschi poi contare le cellule e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. Per PBMC conservati in azoto liquido, scongelamento delle cellule è necessaria. Il protocollo è il seguente: <ol><li> Scongelare la provetta Microbank ™ di cellule in bagno d&#39;acqua a 37 ° C fino quasi completamente scongelati. </li><li> Immediatamente risospendere in 5 ml di R10 media. </li><li> Spin per 5 minuti a 225 x g. </li><li> Risospendere nuovamente in 5 ml di R10 media e contare le cellule vitali con trypan blu. </li><li> Portare la concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml in R10 media. </li><li> Riposo durante la notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> Giorno 2: Configurare la piastra <ol><li> Etichetta coperchio piatto con il numero del campione di identificazione, le condizioni bene, e la data. </li><li> Lavare la piastra 6 volte con 150 ml di PBS sterile 1x con la discarica e il metodo di macchia. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping. Questo potrebbe causare la pozzetti della piastra a diventare viola. </li><li> Aggiungere 100 ml di R20 in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Mentre la piastra è in incubazione, contare le cellule che sono state riposato durante la notte. </li><li> Gira la sospensione cellulare a 1500 rpm per 5 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in modo da avere una concentrazione finale di 1x10 6 cellule per 1 ml a R10 media. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1 ora, togliere la R20 con la discarica e il metodo di macchia. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione delle cellule (10 5 cellule) in ogni pozzetto. Aggiungi peptidi appropriati e / o antigeni nei pozzetti corrispondenti in duplice copia. Usare un puntale nuovo ogni volta che vai nella soluzione di peptide di lavoro. Concentrazione di peptide normale è 10-40 mg / ml. Dal peptidi variano, ogni investigatore dovrebbe titolare peptidi per ottenere risultati ottimali. </li><li> Nei pozzetti di controllo negativo, solo aggiungere le celle (non peptidi) </li><li> Nei pozzetti di controllo positivo, aggiungere fitoemoagglutinina (PHA, 10 mg / ml; Sigma). </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2 (~ 18 ore). </li></ol> Giorno 3: Sviluppare la piastra <ol><li> Lavare la piastra 6 volte con 150 microlitri 1xPBS con la discarica e il metodo di macchia. </li><li> Aggiungere 100 l di PBS in ciascun pozzetto della piastra utilizzando il pipettatore multicanale. </li><li> Mettete la placca in frigorifero per 15 minuti. </li><li> Prendete il piatto dal frigorifero e posizionarlo nel cappuccio coltura di tessuti. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpi biotina <ul><li> Aggiungere 0,5 mg / mL di anticorpi biotina (mAb 7-B6-1) a 11ml di PBS. </li><li> Vortex la soluzione a mescolare bene. </li><li> Se il programma di aggiungere la soluzione con un multicanale, versatelo in un serbatoio. </li></ul></li><li> Eliminare il PBS da sfogliando in cestino. Fare attenzione a non bagnare il piatto mentre dumping. </li><li> Mettere 100 microlitri della soluzione in ogni pozzetto. </li><li> Incubare la piastra nel cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente per un&#39;ora. </li><li> Lavare piastra 6 volte con 150μL 1xPBS con la discarica e il metodo di macchia. Sul lavare 6 °, lasciare la PBS nel piatto prima di aver preparato l&#39;anticorpo Streptavidina. </li><li> Preparare l&#39;anticorpo Streptavidina. <ul><li> Aggiungere 5,5 μ l Streptavidina anticorpi (streptavidina-ALP) a 11ml di PBS (diluizione 1:2000). </li><li> Vortex la soluzione a mescolare bene. </li><li> Se il programma di aggiungere la soluzione con un multicanale, versatelo in un serbatoio. </li></ul></li><li> Gettare la PBS rimanenti nei pozzetti e asciugare la piastra. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di soluzione di streptavidina in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra nel cofano di coltura tissutale a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare le piastre 6 volte con PBS usando la discarica e il metodo di macchia. Sul lavare 6 °, lasciare la PBS sul piatto fino a quando non hanno fatto la soluzione del colore. </li><li> Lavorare al buio. Preparare la soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina (fosfatasi alcalina substrato Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> Aggiungere 4 gocce di reagente substrato 1-11 ml Tampone Tris, vortice bene. Aggiungere 4 gocce di reagente substrato da 2 a tampone Tris, vortice bene. Aggiungere 4 gocce di reagente substrato 3 a tampone Tris, vortice bene. </li></ul></li><li> Eliminare le rimanenti PBS e asciugare la piastra. </li><li> Aggiungere 100 microlitri della soluzione del colore a ciascun pozzetto della piastra con il multicanale. </li><li> Accendere la luce, dopo 5 a 10 minuti di colore via di sviluppo. </li><li> Lasciare i reagenti colore di rimanere sul piatto fino a quando i punti cominciano a diventare viola e sono abbastanza scure. Questo dovrebbe richiedere da 5 a 20 minuti. Fare attenzione a non lasciare la soluzione substrato troppo a lungo, perché ciò potrebbe causare fondo elevato. </li><li> Lavare la piastra ELISPOT 3 volte con l&#39;acqua del rubinetto. </li><li> Lasciare asciugare per circa un&#39;ora o durante la notte. </li><li> Leggere la piastra manualmente o con lettore di piastre ELISPOT. </li><li> Conservare la piastra in una scatola lontano da esposizione alla luce. </li></ol> Rappresentante dei risultati: ELISPOT è stato progettato per quantificare la risposta immunitaria contro gli antigeni microbici. Ogni spot indica una singola cellula di risposta, che esprime la citochina di interesse. Gli spot possono essere contati manualmente o tramite un lettore di piastre ELISPOT. Valutazione che il ELISPOT è stato eseguito correttamente dovrebbe iniziare con un&#39;indagine del controllo negativo per la produzione sfondo della citochina di interesse. Nei pozzetti di controllo negativo ci si aspetterebbe di vedere nessuna macchia, anche se un po &#39;di storia (colore viola) possono essere presenti. Tipicamente, ci deve essere inferiore a una media di cinque punti per bene. I pozzi di controllo positivi confermano che la reazione è stata eseguita correttamente e che le cellule sono sensibili alla stimolazione antigenica. Nei pozzetti di controllo positivo che ci si aspetterebbe di vedere uno sfondo viola scuro a causa di una confluenza di macchie (Fig. 1). Ci dovrebbe essere poco o nessun sfondo bianco. Se il controllo positivo e negativo sono campioni di controllo adeguati, si può poi contare i pozzetti contenenti l&#39;antigene di interesse. Un risultato &quot;non ottimale&quot; sarebbe riflessa dal fondo alto (i pozzi sono viola), senza punti o macchie molto pochi, il centro vuoto, macchie mal definiti o macchie confluenti. Una lista di suggerimenti per la risoluzione è previsto (tabella 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> Figura 1. Un rappresentante della piastra ELISPOT. Ogni piastra deve contenere un controllo positivo, controllo negativo e peptidi di interesse condotto presso il minimo di due pozzi. C9, C10, D9 e D10 sono i pozzetti di controllo positivi, come potete vedere c&#39;è un colore rosso porpora, le cellule confluenti e quasi nessuno sfondo bianco. I pozzi di controllo negativo sono G11, G12, H11 e H12. Questi pozzi non hanno sfondo viola e senza punti come previsto. I punti del G7, G8, H7 e H8, illustrare le risposte cellulari ai peptidi microbici; i punti viola rappresentano una singola cellula di risposta che esprime la citochina di interesse. Tabella 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Osservazione </td><td> Problema Possibile </td><td> Soluzione possibile </td></tr><tr><td> Sfondo ad alta </td><td> 1. Entrambi i lati della membrana non lavate correttamente 2. Troppe cellule secernenti citochine 3. Piastra non secchi correttamente 4. Sulla piastra sviluppato </td><td> 1. Lavare entrambi i lati della membrana con acqua distillata prima e dopo lo sviluppo del colore. Reagenti può fuoriuscire attraverso la membrana nella base del piatto, e questi possono causare elevato background se non lavato via. 2. Ridurre il numero di cellule per pozzetto, questo richiederà l&#39;ottimizzazione 3. Secco il piatto più a lungo prima lettura 4. Ridurre i tempi di sviluppo </td></tr><tr><td> Senza punti / Spot Pochissime </td><td> 1. Non abbastanza cellule secernenti citochine / proteine ​​di interesse 2. Assicurarsi che le cellule vengono stimolate correttamente 3. Cellule non incubate per long abbastanza o potrebbe richiedere del tempo per rispondere alla stimolante 4. Colore sviluppo inadeguato 5. Anticorpi non abbastanza primaria o secondaria </td><td> 1. Aumentare il numero di cellule. Ciò richiederà l&#39;ottimizzazione 2. Inoltre possibile utilizzare un controllo positivo stimolo - uno stimolante che sapete che inducono l&#39;espressione di citochine vostro / proteine ​​di interesse 3. Aumentare il tempo di incubazione di cellule o di utilizzare il metodo indiretto (pre-trattamento di cellule con stimolanti) 4. Monitorare lo sviluppo del colore con un microscopio in testa e assicurarsi che i reagenti di sviluppo sono stati conservati correttamente e non hanno perso l&#39;attività 5. Concentrazione dell&#39;anticorpo primario e / o secondaria dovrà essere aumentato. Ciò richiede l&#39;ottimizzazione. </td></tr><tr><td> Aree vuoto </td><td> 1. Membrana non pre-trattati 2. Membrana si è asciugata in qualche fase 3. Cellule irregolarmente distribuite </td><td> 1. Garantire membrana è adeguatamente pretrattati con etanolo al 70% (tutte le membrane non hanno bisogno di questo in modo da verificare con il fornitore). Lavare bene con PBS 3X dopo 2. Garantire membrana non si secchi 3. Assicurarsi di mescolare delicatamente le cellule di avere un buon omologo sospensione cellulare prima di pipettaggio fuori nei pozzetti </td></tr><tr><td> Centro vuoto </td><td> 1. Danni derivanti dal lavaggio </td><td> 1. Portata in lavaggio automatico (o pipette) potrebbe essere troppo alto. Hai bisogno di una procedura di lavaggio più delicato </td></tr><tr><td> Falsi Positivi </td><td> 1. Aggregati anticorpo secondario 2. Cellule ancora sulla membrana 3. Coltura cellulare contaminazione </td><td> 1. Filtrare l&#39;anticorpo secondario 2. Assicurarsi che tutte le cellule sono lavate dalla membrana con PBS Tween 20 prima di incubazione anticorpo secondario. Cellule sinistra sulla membrana darà irregolari macchie a forma di 3. Mantenere i reagenti come sterile e pulito possibile. Garantire la vostra tecnica di coltura cellulare è asettico. Verificare la presenza di falsi positivi eseguendo un controllo negativo dei media. Per i movimenti delle griglie, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">vedere i punti mal definiti</a> </td></tr><tr><td> Spot confluenti </td><td> 1. Povero rivestimento, anticorpi troppo 2. Coltura cellulare prolungato 3. Cellule sovra-stimolata </td><td> 1. Ridurre la concentrazione di anticorpi primari 2. Più a lungo le cellule sono incubate, più citochina / proteine ​​saranno secernono. Questo si tradurrà in grandi macchie che inizierà a fondersi e diventare indistinguibili. 3. Ridurre il tempo di coltura cellulare fase di incubazione. Eccesso di stimolazione si tradurrà in un sacco di citochine / proteine ​​essere secreta dalla cellula. Questo produrrà macchie che inizierà a fondersi e diventare indistinguibili. Ridurre la quantità di stimolanti nei terreni di coltura o di cultura per un periodo di tempo più breve </td></tr><tr><td> Spot mal definiti </td><td> 1. Membrana non pre-trattati (se la membrana lo richiede, verificare con il fornitore) 2. Movimento piastra durante l&#39;incubazione delle cellule </td><td> 1. La membrana deve essere pre-trattati con etanolo o questo può portare a fuzzy, luoghi scarsamente definiti. Sarà difficile per il lettore a distinguere questi 2. Non lasciare che la piastra di muoversi durante l&#39;incubazione delle cellule come le cellule che si sono trasferiti creerà più di un punto. Se possibile utilizzare un apposito incubatore che non sarà aperto durante l&#39;incubazione. Non toccare la piastra dopo aver aggiunto le cellule </td></tr><tr><td> Positivo Pozzetti di controllo è basso </td><td> 1. Sottosviluppo - può essere una conseguenza dell&#39;uso di streptavidina-ALP e / o BCIP / NBT soluzioni che non sono stati portati a temperatura ambiente </td><td> 1. Portare i reagenti a temperatura ambiente prima di aggiungere ai pozzetti </td></tr><tr><td> La densità dei punti rende difficile quantificarli </td><td> 1. Troppe cellule sono stati aggiunti ai pozzetti </td><td> 1. Diluire di cellule (cioè 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 cellule per pozzetto) per determinare il numero ottimale di cellule che si tradurrà in formazione di macchie distinte </td></tr></tbody></table>

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	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il saggio ELISPOT è emerso come uno dei saggi più importanti e ampiamente utilizzati per monitorare le risposte immunitarie negli umani e una varietà di altre specie. Con il saggio ELISPOT, frequenze di cellule immunitarie può essere misurata a livello di singola cellula senza espansione o la manipolazione di popolazioni di cellule. Saggio ELISPOT è stato ampiamente applicato per indagare antigene risposta immunitaria specifica in varie malattie tra cui infezioni, tumori, allergie e malattie autoimmuni. L&#39;appli...

A. Preparazione di Media <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Materiali A" /> B. Preparazione del tampone Tris <ol><li> Aggiungere 800 ml di DDH 2 O a 1 bicchiere L. </li><li> Misura 12 grammi di Tris e aggiungere il bicchiere. </li><li> Aggiungere 0,12 grammi di magnesio cloruro esaidrato (MgCl 2: 6H 2 O) nel becher. </li><li> Mescolare con agitatore magnetico in automatico piatto mescolando. </li><li> Una volta disciolto, il pH della soluzione a 9,5. </li><li> Aggiungere 200 ml di DDH 2 O per il bicchiere, portandolo fino a 1000 ml. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro di 0,22 micron. </li></ol> Materiali C. necessarie per l&#39;analisi ELISPOT: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Materiali B" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

Immunità adattiva è una componente importante della clearance dei patogeni intracellulari. La capacità di rilevare e quantificare queste risposte negli esseri umani è un importante strumento diagnostico. L&#39;analisi enzima-collegata immunospot (ELISPOT) sta guadagnando popolarità per la sua capacità di identificare le risposte immunitarie cellulari contro gli antigeni microbici, comprese le popolazioni immunodepressi, come quelli con infezione da HIV, trapianto e uso di steroidi. Questo test ha la capacità di quantificare le risposte immunitarie contro specifici antigeni microbici, così come distinguere se queste risposte sono Th1 e Th2 nel carattere. ELISPOT non si limita al sito di infiammazione. E &#39;versatile nella sua capacità di valutare per le risposte immunitarie all&#39;interno del sangue periferico, così come i luoghi di coinvolgimento attivo, come lavaggio broncoalveolare, liquido cerebro-spinale, e ascite. Rilevazione delle risposte immunitarie contro una antigeni singoli o multipli è possibile, così come epitopi specifici all&#39;interno di proteine ​​microbiche. Questo saggio facilita la rilevazione di risposte immunitarie nel corso del tempo, così come distinzioni antigeni riconosciuti dalle cellule T ospite. Doppio ELISPOT colori sono disponibili per il rilevamento di espressione simultanea di due citochine. Recenti applicazioni di questa tecnica sono la diagnosi di tubercolosi extrapolmonare, nonché la ricerca del contributo di antigeni infettive alle malattie autoimmuni.

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Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

L&#39;identificazione di bersagli microbici di immunità adattativa nelle malattie idiopatica può essere realizzato tramite l&#39;uso delle analisi enzima-collegata immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantificazione di Th-1 risposte cellulari immunitarie contro antigeni microbici

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.6K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. L'identificazione di bersagli microbici di immunità adattativa nelle malattie idiopatica può essere realizzato tramite l'uso delle analisi enzima-collegata immunospot.

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

L&#39;uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...