Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia come, come purifica un prodotto genetico difficile da esprimere in E.Coli. I principali vantaggi di questa tecnica sono che nessuna reazione enzimatica, diversa dalla PCR, è il vettore e possono essere utilizzate applicazioni comuni per la purificazione delle proteine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla purificazione proteica negli streptococcus mutans, può anche essere un informato di altre specie di microbiota.
A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Mamiko Yamashita, una studentessa del nostro laboratorio. Dopo la progettazione del primer e l'estrazione genomica del DNA dagli streptococcus mutans, eseguire il primo PCR utilizzando gli streptococcus mutans di tipo selvaggio e il genoma di streptococcus mutans interrotto dal GFC come modelli PCR. Amplificare le regioni che ospitano la parte a valle del gene gtfC e quelle che ospitano il gene di resistenza alla spectinomicina usando il primer gtfC-forward e reverse preparato e il primer spc r-forward e reverse.
Quindi, elettrofora ogni prodotto PCR su gel di agarosio all'1%. Utilizzare un taglia-gel per asportare i frammenti di DNA desiderati di circa 1.000 coppie di basi e 2.000 coppie di basi dal gel in tubi a microcentrifugo. Aggiungere 500 microlitri di tampone solubilizzante in ogni tubo e incubarli per 10 minuti a 56 gradi Celsius per sciogliere le fette di gel.
Purificare i frammenti utilizzando il metodo di estrazione del gel a base di membrana di silice. Eseguire un secondo PCR utilizzando i prodotti del primo PCR come modelli PCR con i primer nidificati in avanti e nidificati. Quando il secondo prodotto PCR non può essere confermato dall'elettroforesi, deve essere progettata la coppia di un altro primer annidato.
elettroforesi cinque microlitri della miscela PCR sul gel di agarosio. Confermare la generazione dell'amplicon appropriato di circa 3.000 coppie di basi mediante immagine di colorazione del gel di bromuro di etidio e procedere secondo il manoscritto. Ora, mescolare cinque microlitri del secondo prodotto PCR concentrato con l'aloquot di 50 microlitri di cellule mutagene di streptococco di tipo selvatico freddo e competenti, congelate in precedenza.
Aggiungere la miscela in una cuvetta di elettroporazione e posizionare la cuvetta nella camera di cuvetta dell'apparecchio di elettroporazione. Dare un singolo impulso elettrico di 1,8 kilovolt, 600 ohm e 10 microfarad per 2,5 millisecondi alle cellule. Aggiungere 500 microlitri di brodo per infusione cervello-cuore nella cuvetta.
Stendere immediatamente da 10 a 100 microlitri della sospensione su piastre di coclea per infusione cervello-cuore contenenti spectinomicina. Incubare le piastre per due o sei giorni a 37 gradi Celsius fino a quando le colonie non sono cresciute a sufficienza per essere raccolte. Dopo la generazione di streptococcus mutans sequenza codificante poliistidina incorporato ceppo e inoculazione notturna senza spettromicina secondo il manoscritto, centrifugare la sospensione della coltura batterica per 20 minuti a 10.000 volte g a quattro gradi Celsius.
Trasferire il supernatante della coltura in un bicchiere da tre litri. Per concentrare le proteine dal supernatante di coltura, posizionare il supernatante da due litri su un agitatore magnetico e iniziare a mescolare vigorosamente. Aggiungere 1.122 grammi di solfato di ammonio e lasciare che il precipitato si formi con agitazione vigorosa a quattro gradi Celsius per un periodo di quattro ore o durante la notte. prossimo.
centrifugare la soluzione precipitata di solfato di ammonio a 15.000 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il supernatante. Con una spatola, raccogli il precipitato e trasferiscilo in un bicchiere da 200 millilitri.
Resuspend i pellet in 35 millilitri di tampone di legame. Quindi, trasferire ciascuno circa 25 millilitri della sospensione in un tubo di dialisi in cellulosa rigenerata. Posizionare il tubo di dialisi in 2,5 litri del tampone legante agitazione su un agitatore a quattro gradi Celsius per dializzare la sospensione.
Sostituire la soluzione di dialisi dopo due ore e continuare la dialisi durante la notte. Successivamente trasferire la sospensione dializzata dai tubi ai tubi di centrifuga e posizionare i tubi nella centrifuga a 20.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Con l'apparecchiatura di filtrazione a sezione, versare il supernatante su un filtro a membrana da 0,2 micrometri per filtrare.
Trasferire il filtrato in un pallone da 75 millilitri. Per frazionare il gtfSI taggato in poliistidina dalla sospensione filtrata, preparare prima una cromatografia di affinità metallica immobilizzata. Dopo aver equilibrato la resina secondo il manoscritto, chiudi il cazzo hoffmanno.
Aggiungere cinque millilitri della sospensione filtrata nella colonna per creare un liquame. Quindi, trasferire tutto il liquame alla sospensione filtrata rimanente e ruotare delicatamente la miscela per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Caricare di nuovo la miscela nella colonna.
Apri il cazzo hoffman pinch per rimuovere la sospensione dal flusso di gravità. Lavare la resina IMAC con 20 millilitri di tampone legante e quindi eludere 20 millilitri di tampone di eluizione per ottenere il gtfSI ricombinante. Successivamente, caricare l'eluato in un tubo centrifugo ultra filtrante e centrifugare la soluzione a 2.000 volte g per uno o cinque minuti per concentrare la soluzione.
Svuotare il contenitore del filtrato e aggiungere 15 millilitri di tampone di stoccaggio nel tubo. Centrifugare nuovamente il campione e ripetere il processo due volte in più. La soluzione gtfSI ricombinante viene infine concentrata a circa un millilitro.
Trasferire il concentrato in un tubo di microcentrifugo e conservare a quattro gradi Celsius. Continuare con il protocollo di ripristino funzionale del resto. In questo protocollo, l'elettroforesi del gel di agarosio mostra che la dimensione di ogni amplicone della prima PCR e della seconda PCR corrispondeva alla dimensione prevista.
Le colonie di Streptococcus mutans sono state trasformate con il secondo prodotto PCR e placcate sulle piastre di coclea per infusione cervello-cuore contenenti spectinomicina. I prodotti PCR colony eseguiti sul gel di agarosio mostrano che ogni amplicone era della dimensione prevista. Proteine purificate con cromatografia ad affinità metallica immobilizzata sono state osservate come una singola banda da SDS-PAGE.
Western blot, eseguita utilizzando l'anticorpo anti-poliistidina, ha confermato che la banda osservata era la proteina prevista con tag poliistidina di 160 kilodaltoni. La capacità di formatura del biofilm derivata dal saccarosio è stata osservata solo con streptococcus mutans di tipo selvatico e streptococcus mutans His-gtfC, che ha formato un biofilm aderente sulla parete del tubo in presenza dell'1% di saccarosio. Questo non è stato osservato nello streptococco mutans delta gtfC.
Tuttavia, l'aggiunta di 25 microgrammi della gtfSI ricombinante ha ripristinato la capacità di formazione di biofilm aderenti in streptococcus mutans delta gtfC. Poiché il successo di questo metodo dipende dalla seconda amplificazione PCR, il secondo prodotto PCR deve essere confermato dall'elettroforesi. Già, la proteina di tipo istidina ottenuta con questo metodo sta anche convocando acidi funzionali, come le interazioni proteina-proteina.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica, in combinazione con l'interruzione genica, ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la funzione genica.
