Ringraziamo canzone Renjie (Wadsworth Nucleo Centro Citometria di flusso) per l&#39;assistenza in analisi di cellule e Helen Johnson (Wadsworth Centro Animal Istopatologia Core) per la preparazione delle sezioni di paraffina. Ringraziamo il Dott. Richard A. Cole (Wadsworth Core Light Centro di microscopia) per l&#39;assistenza con la microscopia confocale e raccolta di immagini. Vorremmo riconoscere Andy Bentley (Wadsworth Center Foto e Illustrazione) per l&#39;assistenza con le animazioni. MDJ è supportato dal Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA è supportato da un Centro di Salute-borsa Wadsworth Research Inc. intramurale post-dottorato. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH HD061916 e GM082978.

Gli animali sono stati alloggiati sotto convenzionali, esenti da organismi patogeni specifici condizioni e sono stati trattati nel pieno rispetto Institutional Animal Care del Centro Wadsworth e uso Comitato (IACUC) le linee guida. 1. Sonda gastrica <ol><li> (Opzionale) topo ceppo Gavage di scelta con l&#39;antigene o microbi di interesse utilizzando un 22 G x1.5-in. blunt-end ago alimentazione (Popper scientifico, New Hyde Park, NY). I volumi di consegna non deve superare i 400 microlitri per topo. </li></ol> 2. Isolamento delle cellule PP per Citometria a Flusso <ol><li> Eutanasia topi da CO 2 asfissia, secondo la cura degli animali istituzionale e uso delle commissioni (IACUC) le linee guida. </li><li> Pulire l&#39;addome con il 70% di etanolo o betadine prima dell&#39;intervento. Eseguire una laparotomia standard che coinvolge un singolo (1 cm) incisione con le forbici chirurgiche di qualità lungo la linea mediana inizio circa 1,5 cm dalla base della gabbia toracica. Esporre il percavità itoneal e identificare il cieco. Snip l&#39;intestino terminale piccolo al ileale-cecale giunzione e rimuovere delicatamente l&#39;intestino nella sua interezza. Fare attenzione a non estendersi troppo il tessuto intestinale mentre viene rimosso dalla cavità peritoneale. </li><li> Posare il piccolo intestino su un letto di tovaglioli di carta umidi o Kimwipes. Bagnare il piccolo intestino delicatamente con soluzione fisiologica per prevenire la disidratazione dei tessuti. Identificare visivamente PPs singoli posti sul lato anti-mesenterico dell&#39;intestino (Figura 1). In genere, un mouse deve 5-10 PP visibili che sono uniformemente distribuiti dal duodeno (prossimale) a ileo (distale). In media, i topi quattro produrrà 23 PP. </li><li> Utilizzando curve forbici chirurgiche, PPS singoli accise delicatamente e metterli in soluzione salina bilanciata di Hank fredda (HBSS). Nota, le forbici devono essere posti curva verso l&#39;alto sopra la PP e poi delicatamente applicata al tessuto. Accise solo il PP (non surrounding tessuto) e trasferimento in HBSS freddo. Nota: Tutte le incubazioni e le fasi di centrifugazione da questo punto in avanti nella sezione 2 dovrebbe essere fatto a 4 ° C per preservare la vitalità cellulare. </li><li> Trasferire PPs in 5 ml di dissociazione Medio Milza e incubare per 15-20 minuti a 37 ° C, mentre scuotendo vigorosamente a 250 giri al minuto. Tempo di incubazione più lungo influenzerà negativamente la vitalità cellulare. </li><li> Per generare una sospensione di cellule singole, PP posto su una sterile (sterilizzato) 70 filtro nylon cella um maglie e forzatamente macinare il tessuto in maglia utilizzando la base di uno stantuffo di una siringa da 1 cc. In alternativa, PPs a sandwich tra due lastre di vetro sterili microscopio smerigliato (autoclave in buste) e delicatamente macinare tessuti con un movimento avanti e indietro. Utilizzare una pipetta sterile di trasferimento per trasferire la sospensione cellulare in una provetta 5 ml Falcon. </li><li> Aggiungere EDTA ad una concentrazione finale di 1 mM alla sospensione cellulare. Incubare su un agitatore per5 min a temperatura ambiente. </li><li> Sospensione cellulare Decantare attraverso un secondo filtro 70 micron delle cellule per rimuovere eventuali aggregati rimanenti detriti cellulari o tessuti. Raccogliere le cellule in un tubo 15 o 50 ml. </li><li> Cellule soggette a centrifugazione dolce (5 min a 500 xg). Decantare il surnatante e risospendere le cellule in tampone di flusso, che è salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 1% di siero fetale bovino (FCS). </li><li> Per determinare il numero e la vitalità cellulare, le cellule diluire 1:10 in trypan blu e ispezionare visivamente le cellule utilizzando un microscopio ottico e un emocitometro. In alternativa, un contatore di cellule Countess (Invitrogen) o uno strumento simile può essere utilizzato per enumerare automaticamente i numeri e la vitalità cellulare. A partire con 20-25 PPs, questo protocollo dovrebbe produrre&gt; 2,5 x 10 6 cellule totali. Ciò equivale a ~ 0,8-1,2 x 10 6 cellule per il mouse. </li></ol> Etichettatura degli anticorpi di cellule di citometria a flusso &lt;inizio ol = &quot;11&quot;&gt; <li> Dispensare cellule (10 5 per pozzetto) in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti fondo tondo. </li><li> Piastra soggetta a centrifugazione leggera (5 min a 1000 xg), e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra. </li><li> Risospendere le cellule in tampone blocco Fc e incubare su ghiaccio per 15 min. Mentre ci sono un certo numero di commercialmente disponibili buffer blocco FC (es. ratto anti-topo CD16/CD32, BD Biosciences), è sufficiente utilizzare un mezzo trascorso da B ratto cellulare di ibridoma (ATCC 2.4.G2) che secerne un anticorpo monoclonale murino contro IgG 1 Fcy recettori per questo passo. </li><li> Piastra soggetta a centrifugazione leggera (5 min a 1000 xg) come sopra, e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra. </li><li> Aggiungere fluoroforo anticorpi coniugati direttamente sospensioni cellulari a diluizione desiderato, e incubare su ghiaccio per 30 min con dondolo continua. </li><li> Piastra di riserva di centrifugazione dolce (5 min a 1.000 xg), e decantaresupernatante capovolgendo delicatamente la piastra. </li><li> Lavare le cellule con 100 pl di tampone di flusso. </li><li> Centrifugare piastra a 1000 xg per 5 minuti, e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra. </li><li> Risospendere le cellule 400 microlitri tampone di fissaggio, che consiste in 300 pl di tampone di flusso e 100 pl di 1% paraformaldeide in PHEM buffer (60 mM, PIPES 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl 2 a pH 6). </li><li> Cellule riserva di citometria a flusso utilizzando un FACSCalibur o equivalente. Analizzare i risultati utilizzando Quest versione inglese del software Pro 5.2. </li></ol> 3. Preparazione di criosezioni PP <ol><li> In anticipo di raccolta di tessuti, aggiungere ottimale temperatura di taglio (OCT) composto a base di stampi 7x7x5 mm plastica. Inoltre preparare una pozza di azoto liquido (&gt; 750 ml) in un secchio dewar o ghiaccio. </li><li> Euthanize mouse e eseguire un laparotamy, come descritto sopra. Rimuovere intestino e il luogo su carta assorbente bagnato. </li><li> Aisolare PPs per cyrosectioning, tagliare 0,5 centimetri segmenti trasversali di piccolo intestino contenenti un unico PP e tessuto trasferimento in una capsula di Petri contenente PBS. Lavare delicatamente il lume di questi segmenti con PBS per rimuovere indesiderati detriti fecali. </li><li> Inserire i segmenti del tessuto intestinale in verticale all&#39;interno di stampi di base contenenti ottobre Immergere gli stampi in azoto liquido e permettono tessuto di congelare completamente (1-2 min). Il colore del PTOM cambia da chiaro a bianco quando il tessuto è completamente congelato. . Per un raffreddamento più graduale (ad esempio, per ridurre la rottura del PTOM), la muffa immergere in un bagno di isopentano raffreddato con vapori di azoto liquido Nota: Indossare occhiali di sicurezza appropriate quando si lavora con l&#39;azoto liquido. </li><li> Rimuovere stampi di base congelati dal azoto liquido con pinze e consentire lo stampo riscaldare a temperatura ambiente per il tempo necessario (~ 10-15 sec) per consentire ai bordi del blocco ottobre per ammorbidire. Per rimuovere il blocco di ghiacciato di ottobre dalo stampo, capovolgere lo stampo e premere delicatamente sulla parte posteriore per espellere il blocco su un panno pulito 4 x 4 pezzi cm foglio di alluminio. Immediatamente avvolgere il tessuto in stagnola e posto in un sacchetto campione etichettato conservati in azoto liquido o in ghiaccio secco. In alternativa, trasferire tessuto in congelatore (&lt;-20 ° C). Utilizzare il tessuto entro una settimana, altrimenti i blocchi diventa fragile con l&#39;età. </li></ol> Criosezionamento <ol start="6"><li> Cryosection il tessuto utilizzando un Leica CM3050S cryomicrotome o equivalente. La temperatura della camera del criostato deve essere impostato a -21 ° C. </li><li> Tendere sezioni che sono 12-14 pm di spessore. </li><li> Raccogliere sezioni su Fisher SuperFrost Plus (o equivalente) vetrini per microscopio e ispezionare visivamente con un basso livello di potenza microscopio ottico. Se più sezioni sono stati raccolti su una diapositiva, in modo che essi sono raggruppati insieme per le applicazioni di colorazione a valle. </li><li> Negozio di tscivola a temperatura ambiente in una scatola e, idealmente, li usano in pochi giorni. </li></ol> Etichettatura di anticorpi criosezioni e analisi al microscopio confocale <ol start="10"><li> Immergere i vetrini in acetone (o metanolo) in vaso tessuto colorazione o rack per 2 min. Incubazione prolungato può causare tessuti per staccare dalla diapositiva. </li><li> Trasferire diapositive a vaschetta di colorazione nuovo e lavare 3 volte con PBS-T (1X PBS con 0,05% Tween-20) per 3 min ciascuna. </li><li> Restringere le sezioni con una penna idrofobo ImmEdge. Questo farà sì che i reagenti e gli anticorpi rimarrà confinato in quell&#39;area durante l&#39;incubazione. </li><li> Incubare i vetrini in tampone di blocco (siero di capra 2% in PBS) per 30 min a 37 ° C in una camera umidificata, al riparo dalla luce. </li><li> Incubare vetrini con tampone blocco Fc (vedi sopra) per 10 min a 37 ° C. </li><li> Immergere i vetrini in PBS-T e asciutto intorno sezioni utilizzando Kimwipes o su altri tessuti assorbenti.Fare attenzione a non toccare le sezioni di tessuto reali. </li><li> Sezioni tissutali overlay con soluzione di anticorpo primario e incubare per 30 min a 37 ° C in una camera umidificata. Anticorpo primario è normalmente diluita in tampone di blocco ad una concentrazione finale di 20 pg / ml. L&#39;uso di anticorpi marcati direttamente primari è desiderabile, perché ben tre anticorpi possono essere combinati direttamente a questa fase. Anticorpi marcati direttamente anche eliminare la necessità di ulteriori passaggi di incubazione dell&#39;anticorpo. </li><li> Lavare i vetrini 3 volte (5 minuti ciascuno) per immersione in PBS. </li><li> Se necessario, i vetrini incubare con anticorpi secondari pertinenti per 30 min a 37 ° C in una camera umida. </li><li> Lavare i vetrini 3 volte (5 minuti ciascuno) per immersione in PBS. </li><li> Incubare i vetrini per 4 min in 1% paraformaldeide in tampone PHEM, come descritto sopra. </li><li> Sciacquare i vetrini con PBS per 1 min. </li><li> Zona intorno a secco sezioni utilizzando Kimwipes o altri assorbireent tessuto. Fare attenzione a non toccare le sezioni di tessuto reali. Usando una pipetta o contagocce, posizionare con cura una goccia di prolungare medie Oro montaggio diretto sulla sezione. Applicare un coprioggetto di vetro sul supporto di montaggio avendo cura di evitare bolle. Utilizzare carta assorbente per assorbire l&#39;eccesso di terreno di montaggio. </li><li> Seal coprioggetti per vetrini da microscopio con smalto commerciale e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Visualizzare le diapositive con una Leica TCS SP5 o equivalente microscopio confocale. </li></ol>

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	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. 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L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo, abbiamo fornito protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l&#39;analisi di citometria a flusso e funzionale e criosezioni per immunostaining. Entrambi i metodi sono altamente riproducibili e facilmente accessibile, fornito un citofluorimetro e criostato sono disponibili. Per investigatori prima volta è opportuno sottolineare che, rispetto alla milza, produzioni di cellule totali di PP sono relativamente scarse. Tuttavia, il protocollo delineiamo generalmente ...

Placche di Peyer (PP) sono aggregati macroscopici organizzati follicoli linfoidi presenti in tutto l&#39;intestino tenue di esseri umani e topi (Figura 1) e costituiscono i siti primari avviate mucosali risposte immunitarie contro antigeni alimentari, batteri commensali, patogeni microbici e vaccini orali 1-4. A differenza di altri tessuti linfoidi periferici, come i linfonodi mesenterici, PPs mancano vasi linfatici afferenti. Come tali, le risposte immunitarie in PP sono guidati in risposta ad antigeni derivati ​​dal lume intestinale. Il campionamento di antigeni luminali è compiuta la dal follicolo-associata epitelio (FAE), che consiste di due enterociti e antigene-campionamento cellule note come cellule M. Sotto la FAE, nel sub-epiteliale cupola (SED) regione, si trova una rete di cellule dendritiche (DC), mescolate con i macrofagi, cellule B e le cellule T CD4 + 5-9. Al centro di ogni follicl PP linfoidee sono cellule follicolari dendritiche (FDC) e una a cellule B ricco di centro in centro germinale, fiancheggiata da cellule T-zone ricche interfollicolari. Campionamento Antigen dai risultati PPs nello sviluppo di IgA + plasmablasts cellule B e le cellule effettrici CD4 + e la memoria che le sementi della lamina propria circostante e garantire l&#39;immunità a una vasta gamma di invasori della mucosa. Dissezione gli eventi immunologici complessi associati con il campionamento antigene, l&#39;elaborazione e la presentazione in PP è un compito arduo, considerando che le cellule PP costituiscono solo una piccola frazione delle cellule linfoidi in totale mucosa intestinale. Per aiutare nella caratterizzazione in vitro di cellule in questo ambiente, forniamo un protocollo per la preparazione di cellule totali topo PP per analisi citofluorimetrica e funzionale, nonché un protocollo per la preparazione di PP criosezioni per immunofluorescenza e immunoistologia. Il nostro protocollo per l&#39;isolamento, la caratterizzazione, e immunostaining di protocolli d&#39;intesaposta cellule PP non è nuova di per sé, come dimostra il fatto che ci sono numerosi riferimenti risalgono a più di 25 anni che citano queste tecniche 5,6,9-11. Piuttosto, il nostro protocollo prevede una snella (e visivo) Metodo per investigatori raccolta PPs per la prima volta. Le tecniche che descrivono facilmente padronanza e prontamente produrre un gran numero di cellule con&gt; la vitalità cellulare del 90%. Il protocollo criosezionamento produce sezioni seriali altamente riproducibili ideali per la colorazione e immunofluorescenza confocale. Inoltre, il nostro protocollo integra altri due articoli recenti Giove. Il primo, di Fukuda e colleghi, descrive l&#39;uso di saggi ligato anello ileali per valutare la diffusione dei batteri patogeni da PP cellule M 12. L&#39;altro, da Geem e colleghi, descrive l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule dendritiche e macrofagi dalla mucosa intestinale del mouse, ma esclude esplicitamente dalla loro analisi PP 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Azienda </td><td> Cat. # </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Ottobre Compound </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 Stampi base mm </td><td> FISHERBRAND </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost Plus Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Bordo Rite Lama </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata (HBSS) senza rosso fenolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron filtro cella </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Spleen dissociazione </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Block </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes ottenuto da 2.4.G2 linea cellulare </td></tr><tr><td> Scissor curvo </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Contessa Cella contatore </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Starplex scientifico </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti e apparecchiature utilizzati in questo studio. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Placche di Peyer (PP) sono parte integrante dei tessuti linfoide associato all&#39;intestino (GALT) e gioca un ruolo centrale nella immunosorveglianza intestinale e l&#39;omeostasi. Antigeni particolato e microbi nel lume intestinale sono continuamente campionata da PP cellule M nel follicolo-associato epitelio (FAE) e trasportato a una rete sottostante di cellule dendritiche (DC), macrofagi e linfociti. In questo articolo, descriviamo protocolli in cui PPs murini sono (i) dissociato in sospensioni di cellule singole e sottoposti a citometria di flusso e (ii) preparato per criosezionamento e immunocolorazione. Per citometria di flusso, PP sono dissociate meccanicamente e poi filtrata attraverso membrane 70 micron per generare sospensioni di cellule singole libere delle cellule epiteliali e detriti grande. Partendo con 20-25 PP (da quattro topi), questo metodo veloce e riproducibile produce una popolazione di&gt; 2,5 x 10 6 cellule con&gt; vitalità cellulare del 90%. Per criosezionamento, frescoPP ly isolati sono immersi in ottimale temperatura di taglio (OCT) medio, snap-congelato in azoto liquido, e quindi sezionato con un cryomicrotome. Le sezioni di tessuto (5-12 micron) sono essiccati all&#39;aria, fissato con acetone o metanolo, e quindi sottoposti a immunomarcatura.

Analisi citofluorimetrica di sospensioni monodisperse del totale delle cellule PP rivela una chiara distinzione tra preparazioni di cellule buone e poveri. In preparazioni di cellule buoni rapporti con oltre l&#39;80% la redditività, la maggior parte delle cellule dimostrano alta forward scatter (FSC), un indicatore di volume cellulare alta, e disperdere lato basso (SSC), un indicatore di granularità delle cellule basso (Figura 2A). In questo esperimento, abbiamo anche volutamente preparato un &quot;c...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

Vi è un crescente interesse per la comprensione delle funzioni immunologiche specifiche sottopopolazioni di cellule nelle placche di Peyer (PP), i siti primari induttivi di gut-tessuti linfoidi associati. Qui delineare protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l&#39;analisi di citometria a flusso e criosezioni PP per immunostaining.

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K Views.  New York State Department of Health. Vi è un crescente interesse per la comprensione delle funzioni immunologiche specifiche sottopopolazioni di cellule nelle placche di Peyer (PP), i siti primari induttivi di gut-tessuti linfoidi associati. Qui delineare protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e criosezioni PP per immunostaining.

Video: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...