Ringraziamo Drs. Alex Gelbard e Willem Overwijk consigli su trasferimento genico idrodinamica. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH (AI098099, SSW), l&#39;MD Anderson Cancer Center for epigenetica, l&#39;MD Anderson Center for infiammazione e cancro (SSW), e il Bob Smith Education Fund RE (HSL).

Approvazione istituzionale deve essere ottenuto in anticipo per tutte le manipolazioni sperimentali qui descritte coinvolgono topi. Questi includono l&#39;uso di topi C57BL6 per l&#39;isolamento di cellule progenitrici del midollo osseo, IFNAR - / - topo come destinatari per trasferimento adottivo di progenitori emopoietici e l&#39;uso di HGT per citochine sovraespressione in vivo. Un alloggio adeguato e la cura degli animali devono essere forniti anche dallo sperimentatore o istituzione. Inoltre, l&#39;approvazione istituzionale può essere richiesta per i plasmidi usati nel trasferimento genico idrodinamico (cioè approvazione DNA ricombinante). Gli studi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso UT MD Anderson Cancer Center. 1. Trasferimento Gene idrodinamico (HGT) Questa operazione deve essere effettuata 2 giorni prima del trasferimento adottivo di CDP per indurre circolante Flt3L per espansione DC in vivo 5. Prepare almeno 5 destinatario topi / gruppo. <ol><li> Per conseguire efficiente HGT, i vasi sanguigni del destinatario IFNAR - / - mice (CD45.2 +) dovrebbero essere dilatate esponendo topi per una lampada riscaldante per 5-10 min. </li><li> Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e disinfettare la coda con il 70% di etanolo. </li><li> Iniettare 5 pg di plasmide codificante Flt3L in 2 ml di PBS sterile nella vena della coda usando un ago G 27. Per la coorte di controllo, iniettare 5 mg di vettore vuoto (Porf) attraverso la vena della coda come indicato. </li><li> Controllo topi per 15-30 min per garantire non ci sono effetti deleteri della iniezione coda vena. Topi Ritorno a struttura alloggiativa per 2 giorni. </li></ol> 2. Isolamento di emopoietiche progenitori dal midollo osseo di topo Questa operazione deve essere eseguita due giorni dopo HGT. Utilizzare CD45.1 congenic + topi come la fonte dei progenitori del midollo osseo per il trasferimento adottivo in destinatario IFNAR - /- animali (CD45.2 +). In questo protocollo, ceppi congenici sono tenuti a distinguere donatore e ricevente DC derivate, così da evitare l&#39;esaurimento immunomediata causa MHC mancata corrispondenza. Circa 10-20 topi saranno tenuti a fornire un numero sufficiente di cellule progenitrici ematopoietiche (10 5 cellule / topo ricevente) per gli esperimenti di trasferimento. <ol><li> Euthanize 10 congenic CD45.1 + topi da CO 2 asfissia e dislocazione cervicale. </li><li> Mettere ogni carcassa su un vassoio dissezione e sterilizzare l&#39;addome e le gambe con il 70% di etanolo. </li><li> Fare un&#39;incisione a metà addome e tagliare attraverso la pelle dall&#39;addome alle gambe, tagliando la pelle per tutta la lunghezza della gamba. </li><li> Rimuovere delicatamente la pelle da ogni gamba, e tagliare e rimuovere le gambe dalla carcassa all&#39;altezza dell&#39;articolazione dell&#39;anca usando forbici affilate. </li><li> Rimuovere con attenzione i muscoli dal femore e tibia di ogni gamba con una lama affilata. </li><li> Rimuovereentrambe le estremità del femore e tibia con un bisturi affilato e pongono ossa in un piatto di coltura contenente RPMI completo (RMPI con 10% di siero fetale inattivato al calore bovino, 1% di penicillina / streptomicina, 1 mM piruvato di sodio e 50 mM β-mercaptoetanolo) . </li><li> Preparare una siringa contenente 1 ml di RPMI completo, collegato a un ago G 27. </li><li> Inserire l&#39;ago 27 G in una delle estremità del femore o tibia. Lavare il midollo osseo dal femore o tibia iniettando delicatamente il completo RPMI nell&#39;osso. Assicurarsi che le cellule del midollo osseo vengono rimossi dalle ossa, che può essere realizzato individuando visivamente mezzi espulso che appare torbida. </li><li> Ripetere il lavaggio ciascun femore e tibia 3x per rimuovere completamente le cellule del midollo osseo. </li><li> Preparate una sospensione singola cella pipettando delicatamente le cellule avanti e indietro 3-5x nella capsula di Petri. </li><li> Rimuovere i detriti passando le cellule del midollo osseo attraverso un colino 40 micron cellulare, ponendo le cellule essudati in una nuova culture piatto. Disrupt eventuali grumi di cellule che compaiono sul filtro con una leggera pressione con la fine di un stantuffo della siringa sterile. </li><li> Lisare i globuli rossi (RBC) presenti nella sospensione totale di cellule del midollo osseo con imprese tampone di lisi RBC secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 2 ml di lisi buffer/4-6 x 10 7 cellule (generalmente celle di un topo) e un tempo di incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule del midollo osseo da cellule in pellet mediante centrifugazione per 4 min a 500 xg, aspirando delicatamente il terreno di coltura, risospendere in 10 ml di tampone FACS (PBS 1x + 2 mM EDTA + 1% FBS), cellule di rivestimento per centrifugazione e delicatamente aspirazione lavaggio buffer. </li><li> Ripetere il lavaggio, come descritto al punto 2.13, per un totale di 2 lavaggi. </li></ol> 3. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) per isolare CDPs Questo passaggio richiede l&#39;accesso a un separatore cellulare MidiMACS e colonne MACS LD per una procedura di selezione negativa iniziale,così come una macchina FACS con almeno 3 laser per purificare il progenitore sottoinsieme multicolore dopo colorazione con anticorpi coniugati modo fluorescente. <ol><li> Dopo il secondo lavaggio nel passaggio 2.14, contare le cellule del midollo osseo. Agglomerare le cellule per centrifugazione come descritto al punto 2.13 e risospendere in tampone FACS per ottenere una concentrazione finale di 4 x 10 7 cellule per 30 ml di tampone FACS. </li><li> Per preparare le cellule per FACS, cellule della linea-negativi vengono prima arricchiscono di una tecnica di selezione negativa che rimuove cellule della linea-positive dalla miscela di midollo osseo mediante tecnica cromatografica perlina magnetica. Per la procedura di selezione negativa, aggiungere 1 mg di ciascuno dei seguenti anticorpi anti-topo ratto commerciale (ABS) che riconoscono i marcatori lignaggio ematopoietiche: CD3, CD19, CD11c, CD11b, e Ter-119 Abs. Le Abs dovrebbe essere aggiunto in un volume di 2 ml / Ab alla sospensione cellulare 30 microlitri di tampone FACS. </li><li> Incubare la sospensione cellulare a 4 ° C per 30min. Seguendo l&#39;incubazione, lavare le cellule due volte con 10 ml di tampone FACS come descritto al punto 2.13. </li><li> Risospendere le cellule per ottenere una concentrazione finale di 4 x 10 7 cells/40 microlitri di tampone FACS. Aggiungere 20 ml di capra anti-topo IgG microsfere magnetiche per ogni 40 ml di sospensione cellulare. Miscelare delicatamente e incubare a 4 ° C per 30 min. Lavare le cellule con 10 ml di tampone FACS come descritto al punto 2.13. </li><li> Risospendere fino a 10 cellule del midollo osseo 8 in 500 ml di buffer di FACS. </li><li> Caricare una colonna MACS LD su un separatore cellulare MidiMACS secondo le istruzioni del produttore e Prerisciacquare la colonna con buffer di 2 ml FACS. </li><li> Applicare la sospensione di cellule di midollo osseo per la colonna, caricando fino a 5 x 10 8 cellule in 2,5 ml di tampone FACS. Garantire un tubo di raccolta (tubo da 15 ml) è posto sotto la colonna. Lavare la colonna 3x con 2 ml di tampone FACS / lavaggio, e raccogliere le cellule che passano attraverso la colonna, che sarà arricchito percellule della linea-negativi. Contare le cellule del materiale eluito (wash-through) dalla colonna. </li><li> Per eseguire la selezione positiva di sottoinsiemi progenitrici ematopoietiche mediante FACS, le cellule macchia con la seguente fluorescente Abs coniugato: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, più una miscela di lignaggio Abs marcatori diretti contro CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 e Ter119 (tutti etichettati con PerCP Cy5.5). Utilizzare 0,5-1 ml di ogni Ab in un volume totale di 100 microlitri. Incubare sospensione cellulare a 4 ° C per 20-30 min. </li><li> Lavare le cellule come indicato nella fase 2.13 e risospendere in tampone FACS ad una concentrazione di 2-3 x 10 7 cellule / ml. Filtrare cellule attraverso un tubo di 35 micron tappo filtro cella per rimuovere i grumi di cellule. Questo ultimo passo è fondamentale per evitare di intasare la macchina FACS. </li><li> Posizionare la sospensione cellulare in un tubo FACS sul palco FACS ed ordinare CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) sulbase del profilo marcatore indicato. Raccogliere le cellule purificati in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di RPMI completo. </li><li> Registrare il numero assoluto di cellule filtrate alla fine della corsa FACS. Agglomerare le cellule per centrifugazione come indicato nella fase 2.13 e risospendere in PBS sterile per esperimenti di trasferimento adottivo. </li></ol> 4. Trasferimento adottivo di CDP Questo passaggio avviene tipicamente nel stabulario dove sono alloggiati i topi riceventi. A seconda della posizione della macchina FACS, può comportare trasporto delle popolazioni di cellule progenitrici purificate nella stabulario prima trasferimento adottivo. Sospensioni di cellule progenitrici devono essere tenuti sterile e trasportati in ghiaccio. <ol><li> Preparare sospensioni cellulari iniettabile diluendo 10 5 CDPs purificate in un volume totale di 100 microlitri di PBS sterile. Posizionare sospensione cellulare in una siringa collegata ad un ago G 27. </li><li> Esporre il destinatario IFNAR - / - </sup&gt; topi (CD45.2 +) a una lampada riscaldante per 5-10 minuti per raggiungere iniezione efficiente attraverso la vena della coda. </li><li> Posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e disinfettare la coda con il 70% di etanolo. </li><li> Iniettare 10 5 FACS-purificate CDP in 100 microlitri di soluzione in coda vena con un ago G 27. </li><li> Controllo topi per 15-30 min per garantire non ci sono effetti deleteri della iniezione coda vena. Topi Ritorno a struttura alloggiativa. </li></ol> 5. Isolamento di PP e misurazione dei pDC Importi <ol><li> A 7-10 giorni dopo il trasferimento adottivo, eutanasia topi riceventi. Aprire delicatamente il mouse dalla dissezione e di esporre l&#39;intestino. </li><li> Rimuovere l&#39;intero intestino e metterlo su carta assorbente PBS-imbevuti. Raccogliere tutti i PP visibili lungo la parete del piccolo intestino utilizzando una pinza sottile e forbici. C57BL6 e IFNAR - / - mice hanno tipicamente 5-10 PP / mouse, che sono differenti da isolate linfoidi follicoli trovatilungo l&#39;intestino tenue 18. Si noti che i partners di progetto sono spesso strutturalmente distinti, anche all&#39;interno di un singolo mouse, assicurarsi così accuratamente tutti i PP sono identificati e sezionati. </li><li> Mettere PP in una capsula di Petri contenente PBS, e utilizzare pinze per rimuovere le feci. Ripetere questa procedura due volte per pulire PP. </li><li> Digest PP con 1 mg / ml di collagenasi IV in 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank 1x (HBSS) in un pallone da 50 ml con agitazione vigorosa per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Posizionare il PP digerita nel vano superiore di un 40 micron setaccio cellulare e forza cellule attraverso il filtro con una siringa sterile stantuffo. Raccogliere la sospensione cellulare PP in un tubo da 15 ml. </li><li> Agglomerare cellule PP tese mediante centrifugazione a 500 xg per 5 min e risospendere in 6 ml di soluzione di Percoll 37% (37% Percoll in mezzo RPMI). Posizionare delicatamente 6 ml di soluzione di Percoll 70% (70% Percoll in RPMI medium) sotto la sospensione cellulare, per formare un passaggio gradiente Percoll. </li><li> Centrifugare le cellule per 20 min at 800 xg con la centrifuga rompere. Le cellule mononucleari migreranno all&#39;interfaccia 37/70%. Dopo centrifugazione, popolazione cellule mononucleate dovrebbe essere raccolto da un&#39;attenta pipettando corrispondenza della zona interfaccia. Pellet cellule raccolte mediante centrifugazione e lavate due volte in 50 ml di RPMI completo / lavaggio. Un grande volume viene utilizzato per garantire la rimozione completa Percoll. </li><li> Colorare le cellule raccolte PP con i seguenti anticorpi per rilevare pDCs murini che derivano dai progenitori adoptively trasferiti (CD45.1 +) o topi riceventi (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) e PDCA-1 (FITC) Abs. Eseguire citometria a flusso delle cellule PP, come indicato nei passi 3.9 e 3.10. Identificare pDCs dal loro CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + fenotipo. Numeri pDC assoluti possono essere determinati dalla seguente equazione: x% pDCs anumero di cellulare tal PP = PP pDCs. </li></ol>

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

La tecnica qui descritta trasferimento adottivo valutato il contributo della CDP alla popolazione PP pDC in topi riceventi che sono carenti in PP pDCs (es IFNAR - / - topi). In esperimenti futuro, sarà importante per valutare il potenziale di altri sottoinsiemi progenitrici nel generare pDCs PP, in particolare se pDCs PP derivano da Flt3 + CLPS. Questa domanda è significativa in quanto non è chiaro il motivo per cui pDCs PP sono unicamente sensibili ai segnali IFNAR-STAT1 per PP accanto...

Qui, dimostriamo un protocollo per valutare se progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP) sono in grado di dare luogo alla cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC), la popolazione in patch di Peyer (PP). L&#39;obiettivo generale di questo metodo è stato quello di valutare la regolamentazione dello sviluppo di pDCs in patch di Peyer (PP pDCs). Il motivo per questo è importante è che pDCs PP differiscono da pDCs trovati in altri tessuti, compreso il midollo osseo, sangue e milza, e pertanto non è chiaro se pDCs PP e altre popolazioni PDC sono evolutivamente e / o funzionalmente connesse. In particolare, pDCs sono ampiamente conosciuto per essere il principale tipo I (IFN) i produttori all&#39;interno del sistema ematopoietico, rispondendo a Toll-like receptor 7 e 9 (TLR7 / 9) stimolazione da una rapida secrezione di IFN 1-3. Tuttavia, pDCs PP sono carenti nella produzione di IFN di tipo I in risposta alla stimolazione TLR agonisti 4,5. Inoltre, PP pDCs anche differire dal pDCs trovano nel midollo osseo e nella milza inrichiede segnali dal interferone di tipo I (IFN) recettore (IFNAR1) o la IFN segnalazione STAT1 molecola per il loro sviluppo e / o l&#39;accumulo 5. Questi dati hanno suggerito la possibilità che meccanismi regolatori distinti controllano pDCs PP rispetto pDCs in altri organi (pe midollo osseo, milza) 5. La logica che ha portato allo sviluppo di questo metodo è basata sui recenti progressi nella comprensione delle cellule dendritiche (DC) biologia. La maggior parte, se non tutti, i sottoinsiemi DC derivano da progenitori ematopoietici che esprimono il tipo fms recettore tirosina chinasi 3 (Flt3) 6-10, tuttavia, lo sviluppo DC non è limitato al classico mieloidi e linfoidi percorsi. Ad esempio, Flt3 + progenitori mieloidi comuni (CMP, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcγR lo / -) dare adito a CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +); la cucih ulteriormente differenziarsi in pDCs e DC convenzionali (CDC) 9,10. Al contrario, Flt3 + progenitori linfoidi comuni (CLPS, Lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit LO) si sviluppano principalmente in pDCs 11. Pertanto, studi precedenti indicano pDCs derivano da almeno due distinte popolazioni progenitrici ematopoietiche ai sensi del regolamento di Flt3L, anche se l&#39;analisi tipica è stato limitato al midollo osseo, milza e / o sottoinsiemi pDC sangue. Così, la popolazione progenitore (s) che genera PP pDCs necessaria indagine. Comprendere le origini del PP pDCs farà luce su se condividono percorsi di sviluppo comuni con altre popolazioni PDC o utilizzare meccanismi distinti durante la loro generazione in PP. Un vantaggio unico dell&#39;approccio descritto è l&#39;uso di topi che mostrano una carenza grave in PP pDCs come destinatari del trasferimento adottivo di progenitori emopoietici. I topi con il genedelezione tic nel gene che codifica IFNAR1 (IFNAR - / - mice) o STAT1 (Stat1 - / -) ha rivelato un impoverimento notevole in PP pDCs 5. Pertanto, questi ceppi forniscono un ambiente in cui pDCs PP sono ridotte, consentendo studi trasferimento adottivo da eseguire in assenza di potenti regimi ablazione cellulare come irradiazione letale. Un ulteriore punto di forza del metodo qui presentato è l&#39;uso di idrodinamica trasferimento genico (HGT) stimolare elevate quantità circolanti di Flt3L. Ciò fornisce un metodo conveniente per indurre Flt3L in vivo, rispetto iniezione di proteina ricombinante. Numerosi studi, compresi quelli nel nostro laboratorio, hanno impiegato HGT per indurre la quantità di citochine in una varietà di condizioni sperimentali 5,12,13. La divisione del lavoro e precise funzioni immunitarie per DC è di grande interesse nel campo dell&#39;immunologia. In particolare, pDCs sono importanti mediatori della tolleranza orale e sistemica antiviralerisposte, ma sembrano anche contribuire allo sviluppo e la persistenza di autoimmunità e cancro 14-17. Il protocollo qui descritto permetterà i meccanismi evolutivi che regolano PP pDCs ad essere più pienamente esplorate. Inoltre, questo approccio può consentire studi per valutare la funzione PP pDC, e può essere esteso a comprendere la regolamentazione e la funzione delle altre popolazioni immunitarie all&#39;interno PP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">664</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">B6.SJL</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">2014</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">11875-093</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352070</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile surgical tweezers</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile small pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile large pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352340</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352235</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RBC lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">R7757</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:260px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Percoll</td>
			<td style="width:201px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:177px;">17089102</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10XHBSS</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4641</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:201px;">Worthington</td>
			<td style="width:177px;">LS004188</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Goat ant-rat IgG microbeads</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-048-501</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LD column</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-042-901</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-D3</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">555273</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD19</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553783</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11b</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553308</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11c</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553799</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-Ter119</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553671</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD3 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0031</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD19 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0193</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11b (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-F4/80 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-4801</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Ter119 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-5921</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Sca-1 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-5981</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD115 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">17-1152</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-c-kit (APC.Cy7)&#160;</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">47-1171</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-1271</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Flt3 (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-1351</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.1 (APC.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">560579</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.2 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">Biolegend</td>
			<td style="width:177px;">109830</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-B220 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-0452</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Siglec-H (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-0333</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-PDCA-1 (FITC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">Nov-72</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">e.g. BD Fortessa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heat lamp</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">309602</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">27&#189; G needles (sterile)</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">305109</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the development of murine plasmacytoid dendritic cells in peyer's patches using adoptive transfer of hematopoietic progenitors

Dettagli Questo protocollo un metodo per analizzare la capacità di progenitori ematopoietici purificati per generare cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) in cerotto intestinale del Peyer (PP). Progenitori delle cellule dendritiche comuni (CDP, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) sono state purificate dal midollo osseo di topi C57BL6 da FACS e trasferiti a topi riceventi che mancano di una popolazione significativa PDC in PP, in questo caso, IFNAR - / - topi sono stati usati come destinatari di trasferimento. In alcuni topi, l&#39;iperespressione del fattore di crescita delle cellule dendritiche ligando di Flt3 (Flt3L) è stato applicato prima adottivi trasferimento di CDP, utilizzando idrodinamica trasferimento di geni (HGT), del Flt3L-plasmide codificante. Flt3L sovraespressione espande popolazioni DC provenienti dalla trasferiti (o endogeni) progenitori ematopoietici. A 7-10 giorni dopo il trasferimento progenitore, pDCs che nascono dai progenitori adoptively ceduti sono stati distinti da cellule riceventi sullabase di espressione marcatore CD45, con pDCs da CDP trasferiti essere CD45.1 + e destinatari di essere CD45.2 +. La capacità di CDP trasferiti a contribuire alla popolazione pDC in PP e di rispondere alle Flt3L è stata valutata mediante citometria a flusso di PP sospensioni di cellule singole da topi riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per verificare se altre popolazioni progenitrici sono in grado di generare PP pDCs. Inoltre, questo approccio potrebbe essere utilizzato per esaminare il ruolo dei fattori che si prevede di influenzare lo sviluppo PDC in PP, trasferendo sottoinsiemi progenitrici con un atterramento opportuno, knockout o sovraespressione del fattore putativo di sviluppo e / o manipolando citochine circolanti via HGT . Questo metodo può anche permettere un&#39;analisi di come pDCs PP influenzano la frequenza o la funzione di altri sottoinsiemi immuni in PP. Una caratteristica unica di questo metodo è l&#39;uso di IFNAR - / - mice, che mostrano gravemente impoverito PP pDCs relative al tipo di animali selvatici, così allowing ricostituzione di PP pDCs in assenza di effetti confondenti da irradiazione letale.

I nostri risultati mostrano la strategia di gating per l&#39;isolamento di CDP da cellule di midollo osseo del topo (Figura 1), come descritto nei protocolli 2 e 3. CDPs costituiscono circa il 0,1% del totale delle cellule del midollo osseo, e circa 4-6 x 10 4 CDP possono essere isolate da un mouse. Al momento del trasferimento adottivo, CDP si differenziano in pDCs e CDC 10. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in...

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Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Questo protocollo descrive procedure sperimentali per valutare la differenziazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi in placche di Peyer da progenitori comuni cellule dendritiche, utilizzando tecniche che comportano l&#39;isolamento FACS-mediata delle cellule, il trasferimento genico idrodinamico, e analisi del flusso di sottoinsiemi immuni in placche di Peyer.

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

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Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

11.1K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Questo protocollo descrive procedure sperimentali per valutare la differenziazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi in placche di Peyer da progenitori comuni cellule dendritiche, utilizzando tecniche che comportano l'isolamento FACS-mediata delle cellule, il trasferimento genico idrodinamico, e analisi del flusso di sottoinsiemi immuni in placche di Peyer. 

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Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

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The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...