1. Telomere Lunghezza protocollo 19 <ol><li> Estrazione del DNA </li></ol> Possono essere utilizzate La maggior parte dei metodi di isolamento del DNA. Il nostro laboratorio preferisce Qiagen Kit DNeasy (# 69506) per le fonti di sangue. A seconda della fonte di DNA, come fonti di buccali o altro, può essere utilizzato un metodo di isolamento differente. <ol start="2"><li> Primers: </li></ol> Tutti i primer sono diluiti ad una concentrazione di magazzino 100pmoles/μl PCR in acqua di grado e conservati a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. Scorte di lavoro dei primer sono fatti freschi e vengono conservati a 20 ° C per un breve periodo di tempo (alcuni mesi). Primers standard sono stati utilizzati per telomeri e β-globina, il SCG, come descritto in O&#39;Callaghan et al. 20 . Sequenze di primer: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Nota: I primer sono diluiti ad una concentrazione di lavoro di 10pmoles/μl, prima di aggiungere alla miscela di reazione. <ol start="3"><li> Diluizioni seriali di DNA genomico: </li></ol> Diluizioni seriali di DNA genomico per Telo e Single Copy Gene (SCG) sono creati per generare una curva standard di valore Ct per il dosaggio. Il DNA genomico è stato estratto da usato linfociti da campioni di sangue. Queste diluizioni sono creati mediante diluizione DNA con grado PCR H 2 0 per ogni concentrazione di un fattore di 1,68 per ottenere le due serie di diluizioni seriali attraverso lo stesso DNA genomico. Le concentrazioni iniziali sono stati ottimizzati in base a prove ed errori e potrebbe essere necessario un aggiustamento quando si usano reagenti differenti, strumenti, di DNA di altre specie, tipi cellulari e SCG utilizzati. Nota: diluizione seriale usando DNA genomico sono fatto mescolando delicatamente e attendere almeno 15 minuti ad un&#39;ora befori prendendo DNA per la successiva diluizione. Ogni diluizione richiede tempo per il DNA genomico a dissociarsi. Per lo stoccaggio, diluizioni seriali a lungo termine aliquote in strisce PCR per la conservazione a -80 ° C. Ogni striscia PCR viene scongelato e utilizzato una volta per evitare di congelare disgelo che possono danneggiare il DNA. <ol start="4"><li> Installazione di reazione per RT-PCR </li></ol> Strumento utilizzato: Roche480 Cycler Luce Reattivo: Roche Luce cycler SYBR-verde Diluire campioni di DNA di prova ad una concentrazione finale di 10 ng / mL. Testiamo la concentrazione utilizzando Nanodrop o Qubit. Abbiamo diluire ulteriormente il DNA da 10ng/μl a 5ng/μl finale. Noi non testiamo di nuovo la concentrazione. Componenti di reazione: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 pl </td><td> H20 </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0,2 microlitri </td><td> SCG 1 </td><td> 0,6 microlitri </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1,8 microlitri </td><td> SCG 2 </td><td> 1,4 microlitri </td></tr><tr><td> Rxn mix </td><td> 10 microlitri </td><td> Rxn mix </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> DNA o di diluizione in serie </td><td> 2 microlitri </td><td> DNA o di diluizione in serie </td><td> 2 microlitri </td></tr></tbody></table> Nota: Master Mix è fatta senza DNA e con un eccesso del 5% al 10%. Sia Telo e SCG si eseguono contemporaneamente sulla stessa piastra utilizzando il seguente programma. Per testare per la precisione, almeno tre repliche di ciascun campione e di controllo deve essere eseguito. Le variazioni dei primer utilizzati possono influenzare i risultati. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per lavorare come segue sul Roche480 Luce Cycler e dei nostri primer. Indenaturare itial 10 min denaturare 95 ° C Ciclismo 95 ° C 10 sec attesa 60 ° C 5 sec stiva 72 ° C 11 sec attesa e acquisizione singolo Ripetere 45-55 volte come richiesto 2. Quantitativa della telomerasi Detection (QTD) Protocol (Basato su Kit QTD da Allied Biotech, Inc. N. di cat. MT3012) Estrarre Preparazione <ol><li> Cellule pellet o del tessuto. </li><li> Lavare una volta con PBS 1x. </li><li> Repellet e remove 1x PBS. * </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 200 ml di 1 x tampone di lisi per ogni 10 5 -10 6 celle o 40-100 mg di tessuto. </li><li> Incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare il campione a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire 160 microlitri della surnatante in una nuova provetta e determinare la concentrazione di proteine. </li><li> Aliquota e rapido congelare l&#39;estratto residuo in ghiaccio secco / etanolo, conservare a -80 ° C. </li></ol> * In tla sua condizione, telomerasi nelle cellule congelate o tessuti è stabile per almeno un anno. Quando scongelato per l&#39;uso, immediatamente risospendere le cellule in 1 x tampone di lisi. 2.1. Testare controlli Controllo inattivazione termica: Per ogni campione, riscaldare trattare un estratto controllo aggiuntivo incubando a 85 ° C per 10 min prima saggio di attività telomerasica. Curva standard per il modello di controllo TSR: Eseguire Quantitative Real-Time PCR utilizzando diluizioni di TSR, un oligonucleotide con una sequenza simile a primer telomeri incluse nel kit per generare una curva standard. <ol><li> Preparare diluizioni seriali 1:05 della concentrazione della TSR (0,5 amoles / mL) con Lysis Buffer </li><li> Eseguire il dosaggio standard di rilevamento della telomerasi utilizzando 1 ml di ogni diluizione TSR, tra cui la concentrazione di magazzino. Queste diluizioni possono essere conservati a 4 ° C per almeno 2 settimane. </li></ol> 2.2. La telomerasi Activity Assayutilizzando QTD Real-Time PCR <ol><li> Per ogni campione, aggiungere quanto segue in un tubo di PCR o PCR a parete sottile piastra (volume totale di 25,0 ml): <ul><li> 12,5 ml di 2 x Premix QTD </li><li> 1,0 ml di cellule o tessuti estratto </li><li> 11,5 ml di acqua PCR Qualificato </li></ul></li><li> Mescolare accuratamente </li><li> Programma Real-Time PCR Detection System secondo il programma di seguito: - 25 ° C per 20 min (reazione telomerasi) - 95 ° C per 10 min (PCR fase di attivazione iniziale) 35-40 cicli di: - 95 ° C per 30 sec (denaturazione) - 60 ° C per 30 sec (annealing) - 72 ° C per 30 sec (estensione) </li><li> Posizionare i tubi di PCR nel termociclatore e avviare il programma di ciclismo. </li><li> Raccogliere il ciclo soglia o valore C T dopo la fine dei cicli. Il ciclo soglia è il ciclo con cui un aumento statisticamente significativo di ΔRn prima rilevazione. </li></ol> 2.3. Analisi dei dati <ol><li> Generatcurva standard EA utilizzando le letture C T e confrontare le attività della telomerasi. </li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La lunghezza dei telomeri fornisce un marcatore cellulare unico per studiare la cellula stressati e invecchiamento e offre approfondimenti sui meccanismi di invecchiamento. Dal momento che era stato prima suggerito il suo ruolo nel processo di invecchiamento, una moltitudine di studi sono stati fatti riguardanti la lunghezza dei telomeri di età, la longevità, la malattia legata all&#39;età, tumori, e lo stress. Per decenni, il gold standard di misura della lunghezza dei telomeri era terminale analisi dei frammenti di...

I telomeri stanno ripetendo DNA esamero (TTAGGG) sequenze trovati alle estremità dei cromosomi. In ogni replicazione cellulare, queste estremità cromosomiche sono accorciati. Se diventano troppo corti, i cromosomi possono subire fusioni telomeri finali, ricombinazione aberrante, e il degrado. Così sufficiente lunghezza dei telomeri manutenzione gioca un ruolo importante nella stabilità cromosomica e la protezione delle cellule 38. Manutenzione lunghezza dei telomeri è fondamentale anche per i geni trovati vicino le estremità dei cromosomi, in quanto la replicazione del DNA non può continuare fino alla fine dei cromosomi 1-2. Conseguentemente, la prevenzione dei telomeri può migliorare la stabilità delle cellule. Numerosi studi hanno riportato che la lunghezza dei telomeri è correlata con la longevità di un organismo e stato di malattia, come ad esempio nel cancro 3-4, 5 diabete, malattie cardiovascolari e 6,7. Ulteriormente, telomeri accorciati sono state associate a stress eccessivo o unstile di vita malsano 8, magari favorendo l&#39;invecchiamento precoce delle cellule e la morte 9. D&#39;altra parte, alcuni studi hanno trovato che non vi è alcuna differenza significativa tra la lunghezza dei telomeri e longevità e malattia legata all&#39;età 39, 40, 41. Uno dei meccanismi innati della cella di protezione da telomeri è attivando un proprio enzima telomerasi trascrittasi inversa (TERT). Questo enzima e la sua subunità, telomerasi RNA (TERC), un RNA non codificante, usano il telomero come modello per aggiungere ripetizioni telomero finisce al cromosoma 10. Anche se l&#39;attività della telomerasi è assente da diversi tipi di cellule e altri meccanismi sono coinvolti nel mantenimento della lunghezza dei telomeri, una maggiore attività della telomerasi è correlata con una maggiore lunghezza dei telomeri. L&#39;attivazione della telomerasi è stato stabilito come uno dei meccanismi con cui le cellule rispondono a danni e lo stress e di evitare la senescenza precoce e morte. Per esempio, più telomeres sono state dimostrate in una popolazione di ebrei Ashkenazi con eccezionale durata della vita 11, mutazioni in TERC o TER hanno dimostrato di contribuire alla malattia fatale 12, e la regolazione epigenetica della telomerasi ha dimostrato di avere un effetto sulla malattia legata all&#39;età 13. Dalla sua scoperta, la lunghezza dei telomeri è stata proposta come biomarker per lo stato di salute in vari modelli animali e negli esseri umani, ma questi primi studi erano difficili da replicare ampiamente quanto il metodo utilizzato era noioso, lungo e costoso. Nel 2002 e ulteriormente sintonizzati nel 2009, Cawthon proposto e dimostrato una nuova accurata PCR protocollo basato,, veloce e semplice per valutare la lunghezza dei telomeri e indagare ulteriormente il suo ruolo in vari aspetti della biologia cellulare, l&#39;invecchiamento e la malattia 19. La scelta del metodo di misurazione dei telomeri corretto per uno studio è essenziale. Attualmente, ci sono vari metodi utilizzati per misurare la lunghezza dei telomeri, ognuno con la propriavantaggi e svantaggi. Tradizionalmente, la lunghezza dei telomeri è misurata usando l&#39;analisi Southern Blot dei frammenti di restrizione terminali (TRFs), che prevede: a. digerendo il DNA con enzimi di restrizione che non tagliare in ripetizioni telomeriche per ottenere TRFs, b. Southern Blot di questi TRFs è fatto da determinare la lunghezza TRF media utilizzando una sonda telomerica 14, 37. Anche se questo metodo è estremamente preciso con un piccolo coefficiente di variazione, è una misura diretta, e può essere vantaggioso per la misurazione distribuzione di lunghezza, analisi TRF è costoso, laborioso e richiede almeno 3 mg di DNA. Questo metodo è anche insensibile a telomeri corti e determinazione lunghezza può essere confuso da subtelomeric DNA, che può essere rilevato dalla sonda a causa della (TTAGGG) n come sequenze che contengono 15, 42. Un altro metodo molto preciso nella misurazione della lunghezza dei telomeri è unico telomeri Allungamento Lunghezza Analysis (STELA), un single molecola metodo basato sulla PCR che richiede solo una piccola quantità di DNA. In questo metodo, i primer sono fatti per riconoscere il G-ricchi sbalzo alla fine di cromosomi e di legarsi ad una sequenza subtelomeric unica su un cromosoma, che amplifica il telomero di un cromosoma specifico. L&#39;amplificazione risultante è quindi visualizzato da Southern Blot. Questo metodo ha il vantaggio di essere estremamente preciso ed è in grado di rilevare valori anomali telomeri corti 16. Purtroppo, dal momento che non tutti i cromosomi hanno le estremità G-ricchi e una sequenza subtelomeric utilizzabile, la lunghezza dei telomeri può essere misurata solo sui cromosomi specifici e queste misure non può rappresentare la lunghezza di tutti i telomeri nella cella 15. Un altro metodo che è stato praticato è l&#39;uso di acido nucleico peptidico (PNA) sonde per rilevare la lunghezza dei telomeri. Florescence Quantitative ibridazione in situ (Q-FISH) ci permette di visualizzare i telomeri durante la metafase, dove la staining di telomeri con una sonda PNA in proporzione alla loro dimensione permette il confronto dei telomeri tra cromosomi specifici. Anche se questo metodo può essere utilizzato anche per le cellule in interfase, qui la lunghezza dei telomeri per i cromosomi distinti non può essere rilevato, che introduce una limitazione quando si misura la lunghezza dei telomeri in cellule senescenti o raramente divisione 17. FISH flusso utilizza invece la citometria a flusso ed è attualmente il metodo più sensibile per misurare la lunghezza dei telomeri delle cellule del sangue in ambito clinico, ma necessita di tecnici altamente qualificati 18. Attualmente, il metodo standard per la misurazione della lunghezza media dei telomeri nel nostro laboratorio si avvale della precisione, sensibilità e facilità di quantitative real-time PCR. Questo metodo è stato reso possibile per la misurazione della lunghezza dei telomeri dallo sviluppo di nuovi primer che evitano la sintesi di prodotti di primer dimero-derivati, che sarebbe stato altrimenti prodotto in quantotandard saggio a causa della natura ripetizione dei telomeri. Per questo test, la misurazione della lunghezza del telomero è rappresentato dal rapporto T / S, il numero di ripetizione copia telomero a singola copia del gene numero. Poiché esiste una relazione proporzionale diretta tra la lunghezza dei telomeri e il numero di primer marcati telomeri legame al DNA durante le fasi iniziali di PCR, il rapporto T / S è direttamente proporzionale alla lunghezza dei telomeri. Il rapporto T / S è misurata confrontando la differenza di Ct, il numero di ciclo frazionario in cui il campione ha accumulato fluorescenza supera una soglia che è diverse deviazioni standard sopra la fluorescenza basale, tra campioni con primer telomeri e SCG primer 19. Questo metodo è stato criticato per la misura indiretta della lunghezza del telomero, che può portare a misurazioni errate, per esempio, nel caso di duplicazioni cromosomiche o copiare variazioni del numero 15. Inoltre, il confronto tra gli studi è spesso difficult, ma standard di oligomeri sono stati sviluppati per misurare la lunghezza dei telomeri assoluto 20. Questo metodo è stato promosso migliorato dai Cawthon, utilizzando un monocromo saggio qPCR multiplex. In questo saggio, la PCR è stata eseguita a temperature più basse per i primi cicli di evitare binding primers dimero e il gene telomero e di controllo sono stati analizzati nella stessa provetta PCR per evitare ulteriori errori. La risultante misure di lunghezza dei telomeri fortemente correlato con la lunghezza dei telomeri misurata mediante analisi Southern blot di TRFs e avevano una maggiore precisione 15, 19, 36. Al momento, qRT-PCR è l&#39;unico metodo conveniente disponibile per esaminare campioni di grandi dimensioni e richiede soltanto una piccola quantità di DNA a svolgere. Una parte fondamentale di questo metodo è ampie misure di controllo della qualità, in modo che quando è fatto correttamente, questo metodo può fornire preziose informazioni comparative sulla lunghezza dei telomeri. Inoltre, questo metodo era stato adattato per l&#39;uso oltre leucociti per misurarelunghezza dei telomeri in una varietà di differenti tessuti 42. Inoltre, al fine di capire meglio la biologia dietro manutenzione lunghezza dei telomeri e le interazioni tra i due effetti opposti (cioè accorciamento dei telomeri durante la replica e l&#39;allungamento dall&#39;enzima telomerasi), abbiamo accompagnato il metodo della lunghezza dei telomeri con un test supplementare che misura l&#39;attività della telomerasi. A questo scopo, abbiamo utilizzato una ripetizione telomerica protocollo di amplificazione, un saggio in vitro. Brevemente, lisato, conservata, le cellule enzimaticamente attive ripetizioni telomeriche sintetizzati su un substrato oligonucleotide utilizzando telomerasi, ed i prodotti sono stati amplificati mediante PCR in presenza di SYBR Green. I risultati sono stati poi analizzati confrontando campioni e di controllo i valori di soglia Ct. Poiché telomerasi è un enzima termosensibile, un ulteriore trattamento termico viene eseguito il controllo accanto a ciascun campione 21. <p class=È necessaria &quot;jove_content&quot;&gt; Durante la misurazione della lunghezza dei telomeri può fornire informazioni preziose sul possibile ruolo della lunghezza dei telomeri nella fisiopatologia dell&#39;invecchiamento e della malattia, la lunghezza dei telomeri non è una struttura statica e ulteriori informazioni per capire la funzione dei telomeri. Studi l&#39;attività della telomerasi possono aggiungere informazioni su telomeri meccanismi di regolazione della lunghezza. Per esempio, l&#39;attivazione controllata della telomerasi può mantenere la lunghezza dei telomeri e proliferazione cellulare, ma l&#39;attivazione incontrollata della telomerasi può provocare il cancro. Questi due metodi poco costosi e dritto in avanti uniti ci ha fornito non solo con forti evidenze verso una relazione tra lunghezza dei telomeri e la stabilità delle cellule, ma anche ulteriori indicazioni circa i possibili meccanismi di accorciamento dei telomeri e di recupero. Con questi metodi si spera di chiarire ulteriormente la risposta della cella di invecchiamento e diversi stati di proliferazione cellulare con l&#39;obiettivo finale di una migliore comprensione della centrale mechanisms di biologia cellulare.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Telomeri ripetono sequenze di DNA alla estremità di punta dei cromosomi che sono diverse in lunghezza e nell&#39;uomo può raggiungere una lunghezza di 15.000 coppie di basi. Il telomero serve come meccanismo bioprotettivi del cromosoma logoramento ad ogni divisione cellulare. A una certa lunghezza, i telomeri diventano troppo corti per consentire la replica, un processo che può portare ad instabilità cromosomica o morte cellulare. La lunghezza dei telomeri è regolato da due meccanismi opposti: logoramento e allungamento. Attrito si verifica come ogni cellula si divide. In contrasto, l&#39;allungamento è parzialmente modulato dal enzima telomerasi, che aggiunge le sequenze ripetute alle estremità dei cromosomi. In questo modo, telomerasi potrebbe eventualmente invertire un meccanismo di invecchiamento e ringiovanisce vitalità cellulare. Questi sono elementi cruciali per il mantenimento della vita cellulare e sono utilizzati per valutare l&#39;invecchiamento cellulare. In questo manoscritto si descrivono un accurato breve sofisticato ed economico metodo per valutare la lunghezza dei telomeri nel tessuto multiplas e specie. Questo metodo sfrutta due elementi fondamentali, il tandem ripetizione della sequenza telomero e la sensibilità del qRT-PCR per rilevare differenziali numeri di copie di campioni esaminati. Inoltre, descriveremo un semplice test per valutare l&#39;attività della telomerasi come test dorsale complementare per la lunghezza dei telomeri.

Un esempio di una lunghezza saggio RT-PCR quantitativa telomeri è mostrato in Figura 1. Sul pannello superiore sinistro, campioni etichettati in rosso e verde rappresentano la posizione dei soggetti testati sulla piastra a 96 pozzetti. Sul pannello superiore destro, la curva di amplificazione è dimostrato. Ogni oggetto è testato da due saggi (telomeri e singola copia del gene), che è fatto in triplicato. A causa di diverse copie di DNA prodotti nelle due saggi di individui selezionati, il numero di ...

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Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Un metodo preciso, corto, sofisticato ed economico è descritto che valuta la lunghezza dei telomeri nei diversi tessuti e specie utilizzando RT-PCR quantitativa. Inoltre, descriveremo un semplice test per valutare l&#39;attività della telomerasi come test dorsale complementare per la lunghezza dei telomeri.

Lunghezza dei telomeri e telomerasi attività; Un Yin e Yang di senescenza cellulare

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Monitoraggio del sistema ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi Utilizzando una degron (dgn)-destabilizzato proteina verde fluorescente (GFP) a base di proteine ​​Reporter

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Ridotto gravità ambiente hardware Dimostrazioni di un prototipo miniaturizzato Citofluorimetro e Companion Microfluidic tecnologia di miscelazione

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...