XHP è stato sostenuto dal National Institute of Health (NIH) sovvenzioni da National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NIHR21HD056530).

1. Soluzione e Media Preparazione <ol><li> Rivestimento in gelatina soluzione: 0,1% (w / v) gelatina in DDH 2 O, autoclave e conservare a 4 ° C. </li><li> Matrigel rivestimento soluzioni. Soluzione: lento disgelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C per una notte, aggiungere 10 ml ghiacciata DMEM o DMEM/F12, mescolare bene e aliquota 1 ml / tubo sotto cappuccio tessuto sterilizzato cultura, conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro: lento disgelo 1 ml aliquota Matrigel a 4 ° C per 1-2 ore, il trasferimento di 14 ml o refrigerata DMEM DMEM/F12 e mescolare bene sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Umano laminina soluzione di rivestimento: diluire 1 ml di soluzione umana laminina (0,5 mg / ml in Tris tamponata NaCl, conservare a -80 ° C, lento disgelo a 4 ° C per 1-2 ore) con ghiaccio freddo o DMEM DMEM/F12 a 12,5 ml soluzione di lavoro (40 mcg / ml) sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento. </li><li> Fattore di crescita soluzioni madri (500-1000X): sciogliere il fattore di crescita a 10 mcg/ Ml in tampone sterile (0,5% di BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolo, 1XPBS) e di memorizzare fino a 50-100 microlitri / tubo aliquote a -80 ° C. </li><li> Mezzi di comunicazione HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO sostituzione del siero (20%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MEM acidi aminoacidi non essenziali (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con 20 ng / ml bFGF prima dell&#39;uso. O la sostituzione di &quot;KO sostituzione siero&quot; con componenti definiti: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM aminoacidi essenziali (MEAA , 1X) e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con bFGF (20 ng / ml), l&#39;insulina umana (20 mg / ml), acido ascorbico (50 mg / ml), umano activina A (50 ng / ml), albumina umana / Albumax (10 mg / ml), e transferrina umana (8 mcg / ml) prima dell&#39;uso. </li><li> Mezzi di differenziazione cardiaca HESC: DMEM/F12 (90%), FBS definita (10%), e L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm). </li><li> Supporti contenenti nicotinamide (NAM): aggiungere NAM ai media HESC o supporti differenziazione HESC cardiaco a una concentrazione finale di 10 mm, filtrato, conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 2 settimane di preparazione. </li></ol> 2. Lastra di rivestimento <ol><li> Piastre cappotto con gelatina: aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione di gelatina a 6 piastre ed incubare una notte a 37 ° C incubatore umidificato. </li><li> Piastre cappotto con laminina: chill gelatina rivestite piatti e rimuovere la gelatina, aggiungere 2,5 ml / o umani e Matrigel soluzione di rivestimento laminina lavoro di pre-refrigerata gelatinizzato 6 pozzetti ed incubare a 4 ° C durante la notte. </li></ol> 3. Passaging e semina hESC indifferenziato in condizioni definite <ol><li> Lasciare colonie hESC crescere fino a 5-7 giorni vecchi, e prendere la cultura piastra hESC a microscopio da dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. </li><li> Seleziona colonie hESC da dividere. Morfologicamente, queste colonie avrebbero dovuto&gt; 75% hESC indifferenziato (smtutte le cellule compatte), di solito leggermente opaco (non bianco-ammucchiati cellule non differenziate cellule chiare) con bordo definito sotto il microscopio da dissezione. Attentamente delineare le colonie selezionate e rimuovere strato differenziato dei fibroblasti che circonda la colonia e tutte le parti differenziate (se presente) della colonia con il bordo della P2 punta pipetta sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente le cellule differenziate staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF. </li><li> Tagliare le colonie hESC indifferenziato in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare. </li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC pozzetto contenente 20 ng / ml bFGF e piscina insieme. </li><li> Aspirare il Matrigel o umano soluzione laminina dalle piastre rivestito fresca. Aliquota 4 ml / h beneCES supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti. Delicatamente trasferire la piastra per incubatore senza agitare e lasciare colonia semi di pezzi durante la notte senza disturbare umidificata in un incubatore a 37 ° C con una atmosfera di 5% di CO 2. </li></ol> 4. Induzione cardiaco di hESC in Sistema Cultura definita con Nicotinamide <ol><li> Al 3 ° giorno dopo la semina, rimuovere la maggior parte dei vecchi media da ciascun pozzetto della piastra e di lasciare i supporti a sufficienza per permettere colonie hESC di essere sommersa (mai permettere hESC ad asciugarsi). Sostituire con 4 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mM nicotinamide (NAM). </li><li> Sostituire vecchi media con i media hESC fresca contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mm NAM a giorni alterni, e permettere cardiaca indotta colonie hESC crescere a 8-10 giorni. Su esponendo a NAM, tutte le cellule all&#39;interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che continueranno a moltiplicarsi. Le colonie aumentano di dimensione, e di 8-10 giorni, und cellule cominceranno ad accumularsi in alcune aree delle colonie. </li></ol> 5. Continuando differenziazione cardiaca in Cultura Sospensione <ol><li> Prendere la cultura piastra hESC microscopio a dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. Attentamente delineare le colonie e rimuovere strato di fibroblasti che circonda la colonia (cellule differenziate migrate dalla colonia) con il bordo della P2 puntale sterile o tirato capillare di vetro. </li><li> Rimuovere i vecchi media mobile contenente cellule di fibroblasti staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco (senza bFGF). </li><li> Tagliare il cardiaca indotta colonie hESC in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare. </li><li> Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC bene (senza bFGF) e piscina insieme. </li><li> Aliquota 4 ml / pozzetto senza siero hESC supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti bassissimo attaccamento e incubare a 37 ° C umidificata incubatore per consentire galleggiante ammassi cellulari (cardioblasts) per formare per 4-5 giorni. </li></ol> 6. Battere Maturazione Cardiomyocyte fenotipo in Cultura adesivo <ol><li> Piscina i supporti contenenti cardioblasts galleggiante insieme in un tubo da 50 ml. Centrifugare a 1400 rpm per 5 min. Aspirare il vecchi media per quanto è possibile e aggiungere pari quantità di mezzi freschi differenziazione hESC cardiaco contenente 10 mM NAM. </li><li> Pipetta su e giù per miscelare cardioblasts galleggianti e aliquota 4 ml / pozzetto a 6-pozzetti. Trasferire le piastre a 37 ° C in incubatore umidificato per consentire cardioblasts di allegare tutta la notte. </li><li> Sostituire i media differenziazione cardiaca hESC contenente 10 mM NAM a giorni alterni. </li><li> Al giorno 8, sostituire con i media differenziazione hESC cardiaco senza NAM, e continuano a sostituire HESC cardiaca media e differenziazionegiornata molto altro. Cardiomiociti battendo cominceranno a comparire in circa 1-2 settimane di coltivazione continua dopo la sospensione del NAM e aumentare di numero col tempo, e avrebbe potuto mantenere forti contrazioni ritmiche e per oltre 3 mesi. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Nicotinamide (NAM) è reso sufficiente a indurre hESC mantenuto nel sistema cultura definita la transizione da pluripotenza esclusivamente ad un fenotipo cardiomesodermal (Fig. 2B). In caso di esposizione di hESC indifferenziato a NAM, tutte le cellule all&#39;interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che down-regolano l&#39;espressione di Oct-4 e cominciare a esprimere il fattore di trascrizione cardiaci specifici (CSX) Nkx2.5 e α- actinina, in linea con un fenotipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Queste cellule differenziate continueranno a moltiplicarsi e le colonie aumentano di dimensione. Aumentata intensità di Nkx2.5 saràsi osservano di solito nelle aree delle colonie in cui le cellule iniziano ad accumularsi (Fig. 2B). Dopo aver staccato la hESC NAM trattati formeranno galleggiante ammassi cellulari (cardioblasts) in una cultura sospensione per continuare il processo di differenziazione cardiaca. Dopo permettendo cardioblasts di allegare e di continuare a trattare con NAM per 1 settimana, battendo cardiomiociti cominceranno a comparire in circa 1-2 settimane di coltivazione continua dopo la sospensione del NAM con un drastico aumento di efficienza rispetto ai spontanea multi-lignaggio differenziazione delle hESC senza trattamento nel periodo di tempo stesso (Fig. 2C). Cellule all&#39;interno dei cluster battendo cardiomiociti esprimerà marcatori caratteristici dei cardiomiociti, tra cui Nkx2.5 e α-actinina (Fig. 2C). Le contrazioni dei cardiomiociti battere sono stati confermati da profili elettrici di essere forte, ritmico, ben coordinato, e ben trascinato, con impulsi regolari che ricorda il p-QRS-T-complessi visto da elettrodi di superficie corporea in elettrocardiogrammi clinica (Fig. 2C, vedi anche il video). I cardiomiociti potrebbero mantenere il loro contrattilità forte per oltre 3 mesi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Figura 1. Schemi complessiva di approccio convenzionale rispetto a piccole molecole-induzione approccio per la differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti verso cellule specializzate funzionale. (A) Uno schema di approccio convenzionale con multi-lineage inclinazione di cellule staminali umane pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale. (B) Uno schema di ben controllata induzione efficiente delle cellule staminali umane pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti da semplice disposizione di piccole molecole. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Figura 2. Nicotinamide induce specifiche cardiaco discendenza diretta di pluripotenza in determinate condizioni e la progressione verso battendo cardiomiociti. (A) Schema raffigurante la linea temporale del protocollo di regia differenziazione cardiaca di hESC. (B) Dopo l&#39;esposizione di hESC indifferenziato di Nicotinamide (NAM) nell&#39;ambito del sistema cultura definita, grande differenziati ottobre-4 (rosso), le cellule negative all&#39;interno della colonia ha cominciato ad emergere, rispetto ai mock-trattati (DMSO) hESC come il controllo. NAM-indotta delle cellule ottobre-4-negativi cominciarono a esprimere Nkx2.5 (verde) e α-actinina (rosso), in linea con primi differenziazione cardiaca. Intensità progressivamente aumentato di Nkx2.5 era di solito osservata nelle aree della colonia in cui cellule hanno cominciato ad accumularsi. Tutte le cellule sono indicati da colorazione DAPI dei loro nuclei (blu). (C) NAM-indotta cardiaco impegnati hESC prodotto cardiomiociti battendo con un drastico aumento dell&#39;efficienza, come valutato dal cellulare clusparametri che visualizzate contrazioni ritmiche (guarda il profilo elettrofisiologiche e il video), e immunopositive per Nkx2.5 (verde) e α-actinina (rosso). Immagini fase di cluster di grandi dimensioni rappresentante battendo cardiomiociti e le immagini di potenza superiore del rappresentante contrazione dei muscoli cardiaci sono indicati (vedi anche il video corrispondente). Le frecce indicano il grande grappolo cardiomiociti battendo utilizzato per la registrazione elettrofisiologica. Profilo elettrofisiologica del cardiomiociti battere spettacoli regolari, trascinato, impulsi ritmici ricorda il p-QRS-T-complessi visto in elettrocardiogrammi clinica. Barre di scala: 0,1 mm. Video: Amministrazione cardiomiociti differenziati da NAM-indotta hESC. Video 1 e 2 video rappresentativi mostrano grande battendo cluster cardiomiociti in circa 1 e 3 mesi dopo l&#39;attacco. Video 3 e 4 mostrano rappresentante contrazione dei muscoli cardiaci a più alto potere. 5 mostra una typical piccolo gruppo cardiomiociti battere spontaneamente differenziata da hESC senza trattamento NAM come controllo. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Clicca qui per vedere video 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Clicca qui per vedere Video 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Clicca qui per vedere video 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Clicca qui per vedere 4 Video.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Clicca qui per vedere video 5.</a>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi in competizione. XHP è il fondatore di Xcelthera. XHP e EYS hanno proprietà intellettuale relativi alle hESC.

Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-lignaggio fase aggregata, in hESC derivati ​​multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali), solo una piccola frazione di cellule (&lt;2%) spontaneamente differenziarsi in cardiomiociti 13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguito, le popolazioni arricchite di cardiomiociti stati in grado di fungere da pacemaker biologico per salvare la funzione di un miocardio danneggiato meccanicamente ed elettronicamente dopo l&#39;iniezione nel cuore di modelli animali 13. In modelli di roditori infartuata, radicato hESC derivati ​​progenie cardiaco sono stati in grado di sopravvivere e maturare fino a 12 settimane, e parzialmente remuscularizzare il cuore ferito e migliorare la funzione contrattile 14,15. Tuttavia, l&#39;inefficienza nella generazione di umani impegnati cellule cardiache attraverso multi-lignaggio differenziazione delle cellule pluripotenti e l&#39;alto rischio di cancerogenicità a seguito di trapianto hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche. Sviluppare strategie per incanalare l&#39;ampio potenziale di differenziazione hESC pluripotenti esclusivamente e prevedibile di un fenotipo cardiaco è fondamentale per sfruttare la potenza di biologia hESC in campo cuore. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1B). Abbiamo scoperto che nicotinamide indotto cardio-lignaggio impegno diretto da phESC luripotent sotto cultura definita che ulteriormente progredita per battere cardiomiociti ad alta efficienza (Fig. 2). Nkx2.5 è evolutivamente conservata fattore di trascrizione homeobox indispensabile per il normale sviluppo cardiaca e le mutazioni del gene sono associate a malattie cardiache congenite umane (CHD), il difetto più comune nascita umana 16. Espressione di Nkx2.5 è il primo marcatore di cellule precursori cuore in tutti i vertebrati finora esaminato ed è essenziale per una corretta septation cardiaco e la formazione / maturazione del sistema di conduzione elettrico 16. Nei vertebrati, l&#39;inizio e il modello di inizio Nkx2.5 espressione o meno coincidere con i tempi e l&#39;area di specifica cardiache in embriogenesi precoce e Nkx2.5 gene continua ad essere espressa attraverso lo sviluppo nel cuore 16. Nel nostro modello hESC, NAM è apparso per attivare l&#39;induzione cardiaco diretto da hESC pluripotenti, promuovendo l&#39;espressione di cardio-specifica transcriPZIONE Nkx2.5 fattore in un processo che potrebbe emulare le specifiche del cardiomesoderm dal epiblast pluripotenti umane in cardiogenesis embrionale. Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo cuore umano come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento NAM, hESC &lt;2% sarà oggetto di differenziazione spontanea in cardiomiociti battendo 12-15. Con il trattamento NAM, siamo stati in grado di generare&gt; 95% precursori embrionale cardiomiociti battito cardiaco e&gt; 50% da hESC mantenuto nell&#39;ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano cuore 12. Recentemente, noto cardio-destino geni determinanti sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo in cardiomiociti battendo post-natale, con una bassa efficienza di &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l&#39;espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica 19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana 4,5, possono non applicare alle cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivato da morula precedente (otto cellule)-stadio embrioni 22, e le cellule riprogrammate artificialmente 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Bioscienze BD </td><td> 356231 </td><td> Fattore di crescita ridotta </td></tr><tr><td> Umano laminina </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out sostituzione siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM soluzione di aminoacidi (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Transferrina umana </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> BFGF umano </td><td> Peprotech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;insulina umana </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Un umano activina </td><td> Peprotech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> FBS definito </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-ben ultrabassa piastra di fissaggio </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Fino ad oggi, la mancanza di una adeguata fonte di cellule cardiache umane è stata la battuta d&#39;arresto importante nella rigenerazione del miocardio umano, sia a base di cellule staminali ematopoietiche o da 1-3 ingegneria dei tessuti cardiaci. Cardiomiociti diventano terminali differenziati subito dopo la nascita e perdono la loro capacità di proliferare. Non ci sono prove che cellule staminali / progenitrici derivate da altre fonti, come il midollo osseo o il sangue del cordone ombelicale sono in grado di dare origine alle cellule contrattili del muscolo cardiaco in seguito al trapianto nel cuore 1-3. La necessità di rigenerare o riparare il muscolo cardiaco danneggiato non è stato raggiunto con la terapia con cellule staminali adulte, sia endogena o tramite la consegna delle cellule 1-3. Le cellule umane geneticamente stabili staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di espansione illimitata e plasticità illimitata, porge un serbatoio pluripotenti per la derivazione in vitro di grandi quantità di cellule somatiche umane che sono limitate al lignaggio nel bisognodi riparazione e rigenerazione 4,5. A causa della prevalenza delle malattie cardiovascolari in tutto il mondo e acuta mancanza di organi, c&#39;è un interesse intenso hESC terapie a base di sviluppo come un approccio alternativo. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di cancerogenicità 6-8 (vedere uno schema a fig. 1A). Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l&#39;isolamento, l&#39;espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specialiinnesti di Zed nei pazienti problematici 9-11. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sostenere la epiblast pluripotence di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole 12 (vedere uno schema in figura. 1B). Dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso nicotinamide (NAM) sufficiente a indurre le specifiche del cardiomesoderm diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al cardioblasts cardiomiociti umani che ha generato battendo ad alta efficienza (fig. 2 ). Abbiamo definito le condizioni per l&#39;induzione di cardioblasts diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di ungrande disponibilità di cellule cardiache per tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Abbiamo stabilito un protocollo per l&#39;induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Views.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Video: Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Ricerca

Biologia

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...